葉嬋琦 李瓊 單建貞 阮健

目前，原發(fā)性肝癌是我國第四常見的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的組織病理學類型，占全部肝癌的85%～90%［1］。HCC 嚴重威脅人民的生命與健康，在中國發(fā)病率為全球發(fā)病率的2.51 倍，死亡率為全球死亡率的2.54倍［2］。由于HCC 早期確診困難，病情發(fā)展迅速，晚期治療方法局限，因此特異性的HCC 生物標志物和作用靶點對于HCC患者的早期診斷和靶向治療的開發(fā)具有重要意義。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3）是GPC 家族中的一個亞型，由硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）鏈和核心蛋白組成，在多種信號通路中發(fā)揮作用，調控腫瘤的增殖及轉移［3］。GPC3在HCC中高表達，而在正常組織中不表達，因此作為HCC的特異性檢測標志物目前已進入臨床應用。本文結合GPC3 的結構和在HCC 中的作用機制，對GPC3在肝癌診治中的應用進展進行綜述。

1 GPC3的結構功能及在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機制

GPC3 是由位于X 染色體上的GPC3 基因編碼的一個70 kDa的蛋白，由核心蛋白、位于C端的兩條HS鏈以及與細胞膜連接的磷脂酰肌醇錨（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨組成。GPC3 基因突變和功能缺失的患者出現(xiàn)過度生長綜合征，表現(xiàn)為發(fā)育異常，而這種發(fā)育異常也可在GPC3 缺失的裸鼠上觀察到。這種GPC3 功能的缺失可導致Wnt 信號通路的改變［3］。

經典的Wnt 信號通路由Wnt 通過G 蛋白偶聯(lián)受體Frizzled（FZD）和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）兩個共受體結合產生，隨后誘導β-catenin在細胞質中累積，并向細胞核移動，進而促進細胞增殖相關基因的表達［4］。Wnt 信號通路的異常激活可以導致多種腫瘤的發(fā)生。GPC3 在HCC 細胞中通過增加細胞膜上的Wnt蛋白的表達，再與其受體FZD形成復合物從而激活經典的Wnt信號通路。GPC3的核心蛋白和HS 鏈均可以和Wnt 相互作用，Li 等［5］通過建立GPC3結構模型，發(fā)現(xiàn)GPC3核心蛋白上的F41及其周圍殘基可形成Wnt結合槽，該槽可與Wnt3a上的一個中間區(qū)域相互作用，在FZD 缺乏的情況下可以促進Wnt 信號轉導。用抗體阻斷該區(qū)域可以抑制Wnt的激活。該研究揭示了GPC3作為Wnt共受體的精確機制。HS 鏈可以穩(wěn)定FZD 并促進復合物的形成，GPC3與Wnt的相互作用表明GPC3可能通過Wnt信號通路調控HCC 的發(fā)生發(fā)展［3］。c-Myc 和Cyclin D1 是Wnt 信號通路的下游增殖相關基因，Cyclin D1可以通過促進肝細胞增殖和腫瘤形成從而引起肝細胞癌變，c-Myc 調節(jié)細胞的生長、增殖和分化［6］。Li等［7］證明c-Myc過表達可增加GPC3水平，相反GPC3水平的升高也會使c-Myc表達升高，從而形成正反饋信號回路。GPC3的過表達引起Wnt信號通路的異常激活，促進c-Myc 和Cyclin D1 等增殖相關基因的表達，進而促進HCC的發(fā)生發(fā)展。

Hippo 信號通路可以調節(jié)器官大小和發(fā)育，YAP是Hippo信號通路中起關鍵作用的轉錄共激活因子，在調節(jié)細胞增殖、組織再生和腫瘤形成中起著至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HCC 組織中的YAP 表達較正常組織高，而經靶向GPC3的抗體HN3處理的HCC細胞中，YAP 總水平則降低并且阻斷Wnt 信號通路，提示Wnt 可能參與了YAP 信號的上游調控［8］。該研究中的GPC3沉默降低了腫瘤細胞增殖速度，重新導入重組YAP 能夠阻止GPC3 沉默引起的細胞凋亡。這表明YAP 在HCC 發(fā)生過程中調節(jié)細胞增殖，且GPC3 可能作為其上游調控因子將Wnt 和YAP 聯(lián)系起來，共同調控HCC細胞的增殖。

2 GPC3在HCC臨床中的作用

2.1 GPC3在HCC中的診斷價值

2.1.1 組織中GPC3 的表達 研究表明，55.7%～100.0%的HCC組織中GPC3 mRNA高表達［9-10］。而在蛋白水平上，70%～90%的HCC 組織中GPC3 表達為陽性［11-13］。Capurro 等［11］通過免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，72%的HCC患者表達GPC3，但在健康肝臟組織或良性肝病組織中未檢測到GPC3 的表達。Wang 等［12］通過免疫組織化學法比較HCC組織與肝細胞腺瘤和局灶性結節(jié)增生組織中GPC3蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在HCC 組織中GPC3 陽性率為75.7%，而在其他組織中則未檢測到。Zhang 等［13］研究則發(fā)現(xiàn)，在87.1%的HBV陽性HCC組織中GPC3表達，而在肝內膽管細胞癌組織中不表達。目前，GPC3 在臨床上已經作為HCC 的高特異性診斷標志物?？紤]到HCC 的異質性，Enan等［14］將與GPC3聯(lián)合CD3作為免疫組織化學檢測的靶標，研究其對HCC診斷的作用，結果顯示兩者聯(lián)合檢測的敏感性為82%、特異性為100%，提示GPC3聯(lián)合多靶標檢測的有效性。

2.1.2 血清中GPC3的水平 由于GPC3可以從細胞表面釋放，血清中GPC3水平也被認為是HCC的潛在標志物。HCC 患者血清中GPC3 蛋白水平陽性率為36.1%～95.0%，而血清GPC3 mRNA 陽性率則為28%～100%［15］。Nault 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，相比于早期HCC 患者，晚期HCC 患者血清GPC3 水平顯著增加。然而，血清中GPC3水平在早期HCC和非HCC患者之間的差異無統(tǒng)計學意義。

由于檢測方法、抗體等因素不同，GPC3在不同患者血清中的檢測水平存在較大的差異，但大多數(shù)研究以及多項Meta 分析的結果表明，HCC 患者血清GPC3水平上調且明顯高于健康對照組和肝硬化或慢性肝炎患者，如Pisit 等［17］檢測到HCC 患者血清中的GPC3 含量平均值為46.3 ng/mL，而健康對照組的血清中未檢測到GPC3，Yu等［18］則指出HCC患者血清中GPC3 含量為（108.7±230.0）ng/mL，正常組織中GPC3含量為（4.0±7.7）ng/mL，而肝硬化或慢性肝炎患者中則為（6.87±9.1）ng/mL，這表明血清GPC3水平具有診斷HCC 的潛力［19-20］。現(xiàn)已有Meta 分析結果指出，同時選用兩種或三種特異性標志物可以更加精確地診斷HCC，通過對比聯(lián)合檢測GPC3、GP73、AFP 和單獨檢測的敏感性、特異性、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR），發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的敏感性、特異性和DOR分別為0.91、0.84和57.51，其中聯(lián)合檢測的敏感性和DOR 均大于單獨檢測，提示這三種特異性標志物聯(lián)合檢測比單獨檢測GPC3、GP73 和AFP 的診斷價值更高［21-22］。

2.2 免疫療法

2.2.1 GPC3 靶向抗體 GC33 是針對GPC3 C 端30 kDa 片段的單克隆抗體。在異位和原位GPC3 陽性的肝癌異種移植模型中，GC33 均能抑制腫瘤生長［23］。在臨床應用中，Nakano 等［24］構建了GC33，并證實其抗腫瘤效果主要是由于抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用、細胞外基質的消失以及巨噬細胞的顯著增加。在美國和日本開展的Ⅰ期臨床試驗中，對晚期HCC 患者進行了GC33 的劑量遞增研究，20例患者分別進行2.5、5、10和20 mg/kg劑量的GC33治療。常見不良事件包括疲勞（50%）、便秘（35%）、頭痛（35%）和低鈉血癥（35%），不良事件的發(fā)生率與劑量無關。GPC3 高表達組的中位進展時間為26.0周，明顯大于低表達組（7.1周），在最高計劃劑量之前未檢測到劑量限制毒性。另有13例患者接受每周5、10 或20 mg/kg 的GC33靜脈注射，常見的不良事件是淋巴細胞減少（77%），NK 細胞減少（77%），C 反應蛋白增加（69%），發(fā)熱（62%）。54%的患者出現(xiàn)3 級不良事件，其中超過2 例患者出現(xiàn)血壓升高（23%）、淋巴細胞減少（23%）和血小板減少（15%）。無4級或5級不良反應，無不良反應導致死亡或停用；13例患者中7例病情穩(wěn)定，6例病情進展，3例病情長期穩(wěn)定在5 個月以上。說明GC33 具有良好的耐受性［25-26］。另一項雙盲Ⅱ期臨床試驗則對185 例早期系統(tǒng)化療失敗的晚期HCC患者進行GC33治療，治療組和安慰劑組之間的不良事件發(fā)生率相同。治療組與安慰劑組的中位無進展生存期和總生存期分別為2.6 個月vs.1.5個月（HR=0.97，P=0.87），8.7個月vs.10個月（HR=0.96，P=0.82）。在之前接受過治療的患者中GC33并未表現(xiàn)出臨床療效，盡管有潛在的跡象表明，更大劑量的GC33作用于GPC3高表達的患者可能會改善預后［27］，但仍需進一步的臨床研究來驗證這一假設。

除了GC33 之外，有研究者還構建了其他單克隆抗體。Phung 等［28］利用高通量流式細胞術鑒定了對GPC3 具有高結合親和力的小鼠單克隆抗體YP7，YP7 識別一個與人源GC33 結合位點重疊的GPC3 C端表位，在小鼠移植瘤實驗中顯示出明顯的抗腫瘤作用。Gao 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，HS20 抗體可以干擾GPC3與Wnt3a 的結合，抑制Wnt/β-catenin 信號轉導，且在接種HCC 細胞的裸鼠體內表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性。Miao 等［8］利用靶向GPC3 的抗體HN3 發(fā)現(xiàn)，通過影響YAP信號通路能有效抑制HCC細胞生長。

此外，Yu等［30］構建了新型靶向GPC3/CD3的雙特異性抗體，在體外使T 細胞作用于GPC3 陽性腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體可以顯著抑制腫瘤生長，提示靶向GPC3/CD3 的雙特異性抗體具有作為HCC 治療藥物的潛力，相關臨床研究有待進一步開展。

2.2.2 肽疫苗 Komori 等［31］在HCC患者中鑒定了人白細胞抗原（HLA）-A24 限制性CTL 表位GPC3 298-306 肽和HLA-A2 限制性表位GPC3 144-152 肽。針對這些表位研發(fā)的肽疫苗的臨床前研究提示其具有快速的抗腫瘤作用［32］。一項非隨機Ⅰ期臨床試驗報道了上述兩種多肽疫苗用于晚期HCC患者具有高耐受性，33 例晚期HCC 患者接受GPC3 肽疫苗接種，未見劑量限制毒性和劑量特異性不良事件，4例患者出現(xiàn)3級血液不良事件，這些事件與治療無關而與疾病進展有關［33］。該研究中所有患者在注射部位出現(xiàn)1級或2級局部皮膚反應，在大多數(shù)患者中觀察到短暫的免疫相關事件，包括藥物發(fā)熱、皮疹和潮紅，5例患者出現(xiàn)輕微瘙癢癥狀，30例患者可出現(xiàn)GPC3特異性CTL應答。在Ⅱ期對照研究中，35例接受手術后接種疫苗的患者和33例單獨接受手術的患者的1、2年復發(fā)率分別為28.6%、54.3%和39.4%、54.5%。25 例接受手術和接種疫苗的患者的腫瘤呈GPC3陽性，與僅接受手術的21例GPC3陽性患者相比，該組的復發(fā)率明顯降低（1年和2年復發(fā)率分別為24%和48%、52.4%和61.9%）［34］。這一結果表明，GPC3 肽疫苗對于接受切除或射頻消融的HCC患者可能具有輔助治療的作用。

除上述兩種疫苗，還有5 個GPC3 衍生的長肽可以誘導HLA Ⅱ類限制性的Th1 細胞應答，這些肽誘導的Th1 細胞應答與總生存時間延長密切相關［35］。盡管還缺乏臨床試驗，但這些肽對于改善以GPC3肽為基礎的HCC 免疫治療具有相當廣闊的前景。此外，有報道顯示，阻斷程序性死亡受體-1/程序性死亡受體-配體1（PD-1/PD-L1）可通過增加疫苗誘導的CTLs 的免疫應答來增強GPC3 衍生肽的抗腫瘤作用［36］。這為在臨床上使用GPC3 肽疫苗聯(lián)合其他藥物提供了理論基礎。

2.2.3 免疫毒素 免疫毒素是抗體片段與毒素片段融合產生的嵌合結構，主要通過抗體誘導的細胞信號失活和毒素誘導的蛋白合成抑制兩種機制使腫瘤消退。

Gao 等［37］構建了免疫毒素HN3-PE38 和YP7-PE38，結果顯示HN3-PE38 對小鼠HepG2 的抗腫瘤作用高于YP7-PE38。YP7-PE38 識別C 端表位而不抑制Wnt 信號通路，而HN3-PE38 與GPC3 的N 端和C 端結合，且其抗腫瘤細胞毒性涉及Wnt 誘導的βcatenin 信號通路和YAP 信號通路的抑制。然而，PE38誘導的脫靶效應和中和抗體導致了劑量限制和抗腫瘤療效降低。二代片段mPE24顯示出較低的脫靶效應和較強的腫瘤抑制作用。Wang 等［38］構建了HN3-mPE24，研究其在HCC 移植瘤小鼠中的安全性和抗腫瘤效果發(fā)現(xiàn)，HN3-mPE24 具有更高的GPC3結合能力，可顯著誘導腫瘤消退，延長生存，并減少不良反應。免疫原性以及血清的半衰期可能會限制免疫毒素在臨床的應用，有研究發(fā)現(xiàn)新構建的HN3-ABD-T20 在血清中的半衰期延長，提示其在HCC 中具有較高的療效［39］。雖然還需進一步的臨床研究，但目前的數(shù)據表明，靶向GPC3的免疫毒素有望用于HCC治療。

2.2.4 細胞免疫療法 Jiang 等［40］通過體內研究表明，抗GPC3 CAR-T治療對含有來自患者異種移植肝癌小鼠模型有效。目前，有11 個臨床試驗正在研究以GPC3 為靶點CAR-T 治療肝癌。一項已完成的Ⅰ期試驗（NCT02395250）首次報道了CAR-GPC3 T 細胞在HCC患者的早期抗腫瘤活性和該療法的初步安全性，共有13例患者接受CAR-GPC3-T治療，觀察到有13例發(fā)熱、12例淋巴細胞減少、9例細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），其中8例1/2級的CRS 是可逆的，1 例CRS 為5 級，無神經毒性［41］。該研究中的3年、1年、6 個月的總生存率分別為10.5%、42.0%、50.3%，有2例部分緩解，1例病情穩(wěn)定的患者生存44.2個月，證實以GPC3為靶點的CAR-T用于治療HCC患者的可行性。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，誘導IL12 表達或者共表達IL15和IL21的GPC3-CAR-T細胞均可以增強抗腫瘤活性［42-43］。Guo等［44］通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除CAR-T 細胞上的PD-1 基因的表達，結果顯示PD-1 缺陷的CAR-T 細胞在體外表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性，且PD-1的缺失可以阻止GPC3-CAR-T細胞的死亡，提示免疫檢查點基因的編輯可以增強CART 對HCC 的治療作用。有研究也發(fā)現(xiàn)通過共表達可溶性PD-1 蛋白阻斷PD-1/PD-L1 通路，增強了GPC3-CAR-T 細胞的抗腫瘤活性［45］。Wu 等［46］通過將索拉非尼與CAR-T 細胞結合作用于小鼠，發(fā)現(xiàn)索拉非尼可以促進CAR-T細胞的抗腫瘤作用。上述小鼠體內實驗顯示CAR-T聯(lián)合靶向或免疫方法能更有效地治療HCC。目前本院正在開展針對GPC3 陽性患者的GPC3-CAR-T 細胞聯(lián)合或不聯(lián)合靶向、免疫治療的臨床Ⅰ期研究（NCT03980288）。

限制CAR-T的臨床應用的因素還包括對機體的不良反應，如“細胞因子風暴”導致組織器官的衰竭、脫靶效應而對正常組織產生的損傷作用。Liu等［47］通過分裂CAR-T 細胞的結構，觀察到不同的結構可以減少相關促炎因子的釋放，增加其對腫瘤治療的安全性。此外，自然殺傷（natural killer，NK）細胞釋放的細胞因子比CAR-T細胞作用產生的“細胞因子風暴”更安全，且CAR-NK 可以降低自身免疫反應和腫瘤轉化的危險［48］，針對CAR-NK 的研究正在開展。Yu等［49］通過第二代特異性靶向GPC3 的CAR 技術構建NK-92/9.28.z 細胞系，在體外觀察到該細胞系對GPC3陽性的HCC細胞具有細胞毒性，同時該細胞系對高水平和低水平GPC3 的HCC 異種移植瘤具有較高的抗腫瘤活性，而對GPC3 陰性的HCC 則無活性，這表明以GPC3為靶點的CAR-NK是治療GPC3陽性HCC 的一種新選擇。Huang 等［50］研究認為共刺激信號在CAR-NK 治療HCC 中是必需的，構建含不同共刺激結構域的抗GPC3-CAR 質粒，從而生成不同的CAR-NK-92 細胞，通過觀察不同結構域對CAR-NK細胞增殖的影響以及CAR-NK-92 對HCC 細胞的作用，發(fā)現(xiàn)使用DNAM1 和2B4 這兩個共刺激域構建的CAR-NK-92 在體外能增強HCC 細胞活性。靶向GPC3的CAR-NK在HCC治療中具有較大的潛能，這一方面還需要進一步的研究。

2.3 基因療法

針對GPC3 的基因治療包括miRNA、shRNA 和siRNA 等分子的應用。靶向GPC3 的miRNA 在肝癌異種移植模型中顯示出抗腫瘤作用。本課題組前期研究表明，使用GPC3 shRNA可顯著抑制HCC細胞的增殖和侵襲［51］，誘導細胞周期停滯在G1 期以及細胞凋亡［52］。此外，利用siRNA 敲低GPC3 可以通過下調YAP基因抑制HCC細胞增殖、誘導細胞凋亡，并可通過上調TGF-β 抑制HCC 細胞生長［8，53-54］。為了克服siRNA 在臨床應用中不能有效傳遞的缺陷，Wang等［55］構建了一種在體外表現(xiàn)出抗腫瘤作用的納米載體（NP-siRNA-GPC3 Ab），細胞毒性小，能顯著抑制小鼠原位HCC異種移植瘤的生長。而關于這方面的應用還需要更多的臨床研究。

3 結語

綜上所述，雖然GPC3在HCC發(fā)生中的作用機制尚未完全明確，但已知GPC3可以通過多個信號通路影響HCC 的發(fā)生發(fā)展。而目前關于GPC3 在HCC 臨床中作用的研究已經有很大的進展，由于GPC3 在HCC 中的高表達，可以作為診斷HCC 的特異性標志物，通過結合其他標志物可以提高準確性。靶向GPC3的免疫治療以及基因治療均表現(xiàn)出較好的發(fā)展前景，這些正在進行的研究將有助于確定GPC3作為HCC 治療靶點的作用。將GPC3 靶點與其他治療手段相結合，如深入研究靶向GPC3-CAR-T 與其他現(xiàn)有治療方法的結合，改善已有治療手段的不足，將成為HCC治療的重要研究方向。