蔣春艷，陳木興，謝麗平，林濤發(fā)，王少揚(yáng)

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院?？偨虒W(xué)醫(yī)院，福州350000；2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)被列為全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，我國(guó)HCC發(fā)病及死亡人數(shù)在全世界范圍內(nèi)占比均為50%左右[1]。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，癌周結(jié)構(gòu)和細(xì)胞群體均發(fā)生改變，這種惡性細(xì)胞與周圍非惡性基質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)成分和動(dòng)態(tài)相互作用被稱為腫瘤微環(huán)境[2]。免疫細(xì)胞分布和功能異常是HCC發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制，也是HCC微環(huán)境改變的主要特征。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫調(diào)節(jié)成分，具有獨(dú)特的免疫抑制能力，可以削弱機(jī)體的抗腫瘤能力，協(xié)助腫瘤細(xì)胞完成免疫逃逸[3]。LAP+CD4+T細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的一種Tregs亞群[4]，具有比經(jīng)典CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞更強(qiáng)的腫瘤抑制活性[5]。有研究表明，LAP+CD4+T細(xì)胞具有比LAP-CD4+T細(xì)胞更高的腫瘤組織歸巢傾向，提示LAP+CD4+T細(xì)胞可能參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6]。但是關(guān)于LAP+CD4+T細(xì)胞比例在HCC腫瘤微環(huán)境中的變化及臨床意義鮮有報(bào)道。為此，本研究觀察了HCC患者癌組織中LAP+CD4+T細(xì)胞比例變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月～2018年10月于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院進(jìn)行初次手術(shù)治療的HCC患者30例，男22例、女8例，年齡27～71歲，血清甲胎蛋白(AFP)<200 ng/mL 16例，≥200 ng/mL 14例；AST/ALT<1.0 17例，≥1.0 13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。患者均經(jīng)術(shù)后病理確診為HCC，排除接受過(guò)靶向藥物治療、射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞及免疫治療等抗腫瘤治療的患者，合并自身免疫性疾病的患者。本研究通過(guò)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例檢測(cè) 選取患者術(shù)中切除的新鮮癌組織及距腫瘤2 cm處相應(yīng)的癌旁組織(大小約為2 cm×1 cm×1 cm)，去除壞死組織、脂肪及其他正常組織。眼科剪剪碎，置入配制好的組織消化液中，37 ℃條件下恒溫震蕩消化1 h。70 μm一次性細(xì)胞濾網(wǎng)濾過(guò)，將濾液吸至15 mL離心管中，25 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，吸去上層清液，沉淀中加入PBS 4 mL重懸，制備細(xì)胞懸液。各取100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液(北京索萊寶生物有限公司)2 mL，依次緩慢加至另一個(gè)15 mL離心管中，于最上層加入細(xì)胞懸液4 mL，25 ℃條件下2 000 r/min離心35 min，一次性無(wú)菌吸管收集100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液之間的云霧狀細(xì)胞層。加入PBS 3 mL，1 500 r/min離心10 min，25 ℃條件下洗滌2次。加入1%BSA重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/mL。每份標(biāo)本各取出100 μL分裝于2個(gè)EP管中，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)管與同型對(duì)照管。暗室條件下各取5 μL抗CD4、抗LAP抗體(美國(guó)eBioscience公司)加入實(shí)驗(yàn)管，同型對(duì)照管加入相應(yīng)同型抗體，暗室中室溫孵育40 min。加入PBS 500 μL，25 ℃條件下2 000 r/min離心6 min，棄上清后重懸。上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)LAP+CD4+T細(xì)胞比例占總CD4+T細(xì)胞的百分比，即為L(zhǎng)AP+CD4+T細(xì)胞比例。分析癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細(xì)胞比例比較 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細(xì)胞比例分別為11.57%±1.59%、5.74%±0.89%，兩者比較P<0.01。

2.2 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例與性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無(wú)關(guān)(P均>0.05)，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的HCC患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HCC患者癌組織LAP+CD4+ T細(xì)胞比例與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

免疫逃逸是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞，以及惡性細(xì)胞隨后存活所必需的關(guān)鍵機(jī)制。免疫系統(tǒng)可以通過(guò)一種叫做免疫編輯的復(fù)雜機(jī)制來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的形成[7]。在清除階段，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可以被免疫細(xì)胞(如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)破壞;但在平衡階段，腫瘤細(xì)胞可降低其免疫原性，以逃避免疫殺傷機(jī)制，最終在逃逸期形成腫瘤。肝臟通過(guò)門靜脈不斷暴露在各種高水平的抗原中，肝臟微環(huán)境表現(xiàn)為強(qiáng)大的免疫抑制作用，以防止自身免疫性肝損傷的發(fā)生[9]。在肝臟免疫微環(huán)境中，Tregs和髓源性抑制細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)揮抑制免疫反應(yīng)作用，從而促進(jìn)肝臟腫瘤的發(fā)生[8]。鑒于肝臟特殊的免疫環(huán)境，臨床上需要充分研究肝臟腫瘤微環(huán)境中免疫成分的改變，從而進(jìn)一步明確免疫成分在產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中所發(fā)揮的作用。

研究表明，HCC患者癌組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Tregs數(shù)量增加[10]。一項(xiàng)關(guān)于肝癌的研究顯示，通過(guò)抑制Tregs功能可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)[11]。Tregs在HCC患者血液中的比例明顯升高，而Tregs比例與HCC嚴(yán)重程度有關(guān)[12,13]。此外，與癌旁組織相比，癌組織Tregs大量聚集后伴隨CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少[14]。因此，腫瘤浸潤(rùn)性Tregs數(shù)量增加可能促進(jìn)了HCC的進(jìn)展，并有可能與患者預(yù)后不良有關(guān)。LAP是一種前肽，與TGF-β的氨基末端非共價(jià)結(jié)合并產(chǎn)生潛伏的TGF-β復(fù)合物，從而促進(jìn)TGF-β1向細(xì)胞外基質(zhì)釋放。此外，潛伏的TGF-β復(fù)合物可表達(dá)于血小板、樹突狀細(xì)胞和Tregs等多種免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜，并參與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[6]。LAP+CD4+T細(xì)胞是人外周血中非Foxp3+陽(yáng)性抑制細(xì)胞的一個(gè)新子集，在體外可以抑制其他T細(xì)胞增殖，其抑制作用可能由TGF-β和IL-10介導(dǎo)[3]。本研究結(jié)果顯示，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例升高，癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例與患者的性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無(wú)關(guān)，但TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者，說(shuō)明LAP+CD4+T細(xì)胞可能通過(guò)其自身免疫抑制性而促進(jìn)HCC進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例明顯高于癌旁組織，提示LAP+CD4+T細(xì)胞具有一定向腫瘤組織歸巢的趨向性;但是,隨著HCC疾病進(jìn)展，這些細(xì)胞是否會(huì)在腫瘤微環(huán)境中積累并向外周血釋放仍需進(jìn)一步觀察。

綜上所述，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細(xì)胞比例升高，且LAP+CD4+T細(xì)胞可能參與了HCC的疾病進(jìn)展。