馮道夫，章志翔

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 普通外科，天津 300052）

William Coley教授首先發(fā)現(xiàn)免疫宿主系統(tǒng)對控制癌癥的進(jìn)展起到關(guān)鍵作用，他發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期肉瘤患者因同時感染兩種嚴(yán)重的細(xì)菌性皮膚病而使腫瘤完全緩解（CR）[1]。再者，免疫生物學(xué)揭示了免疫檢查點(diǎn)可協(xié)助腫瘤逃逸，從而研發(fā)出很多新型治療手段，如：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4，CD152）、程序性細(xì)胞死亡蛋白1 （P D-1，C D 2 7 9）/程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1（PD-L1，CD274，B7-H1）[2-4]。黑色素瘤、腎細(xì)胞癌與非小細(xì)胞肺癌已經(jīng)表明免疫檢測點(diǎn)抑制治療能夠持久緩解腫瘤生長。例如，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤同時接受ipilimumab（抗CTLA-4抗體）與nivolumab（抗PD-1抗體），17%患者達(dá)到完全緩解效果，2年總體生存率達(dá)79%[5]。因此，免疫治療能夠使難治性腫瘤達(dá)到完全緩解，并有較長的緩解期。隨著抗PD-1單抗的上市，哪類患者能夠通過生物標(biāo)記物來預(yù)測抗PD-1/PD-L1治療的療效顯得尤為重要。這樣不僅能夠知道哪些患者對該治療沒有效果，而且能夠減少患者出現(xiàn)抗體所致的自身免疫副作用[6]。

P D-1 是T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)，其作用是在T 細(xì)胞活化效應(yīng)期阻止自身免疫發(fā)生，也誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)的PD-L1與程序性細(xì)胞死亡蛋白2（PD-L2，B7-DC）產(chǎn)生免疫耐受[7]。類似于CTLA-4，PD-1也可表達(dá)在調(diào)節(jié)T細(xì)胞（該免疫細(xì)胞可作用于免疫抑制的腫瘤微環(huán)境）以及活化的B細(xì)胞與NK細(xì)胞上[7]。P D-1/P D-L 1 的活化導(dǎo)致T 細(xì)胞的免疫耐受。在PD-1與PD-L1敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中，自身免疫表型要輕于CTLA-4敲除鼠[8-9]。該結(jié)論與臨床實(shí)踐中抗CTLA-4單抗比抗PD-1或抗PD-L1抗體出現(xiàn)的副作用較多是一致的[10]。

PD-L1表達(dá)在不同的細(xì)胞上，包括胎盤、血管內(nèi)皮、胰腺胰島細(xì)胞、肌肉、肝細(xì)胞、上皮、間充質(zhì)干細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及肥大細(xì)胞[11]。PD-L2作為PD-1第二個配體，存在表達(dá)的細(xì)胞更局限，主要在樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及肥大細(xì)胞上[12]。免疫攻擊因釋放IFN-γ導(dǎo)致黏膜的PD-L1上調(diào)，從而形成“免疫護(hù)盾”來保護(hù)慢性炎癥或感染所致的自身免疫損傷。上調(diào)的PD-L1與T細(xì)胞的PD-1相結(jié)合，達(dá)到消耗T細(xì)胞的目的[13]。與正常黏膜防止自身免疫攻擊作用相似，腫瘤細(xì)胞通過過表達(dá)的PD-L1來躲避免疫監(jiān)視，從而使腫瘤生長。本文主要對前期的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與PD-L1免疫組化作為應(yīng)用抗PD-1免疫治療前的生物標(biāo)記物指標(biāo)進(jìn)行總結(jié)。

1 實(shí)體腫瘤的PD-L1 過表達(dá)

目前，PD-1/PD-L1抑制劑均需檢測PD-L1的表達(dá)。PD-L1的檢測是基于細(xì)胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗(yàn)中以免疫組化方法為主。免疫組化是檢測蛋白表達(dá)的經(jīng)典手法，其通過抗體著色后由病理醫(yī)師鏡下觀察根據(jù)著色深淺來評價表達(dá)情況。目前在非小細(xì)胞肺癌治療中，對于每個PD-1/PD-L1抑制劑，開發(fā)了特異性PD-L1免疫組化檢測方法，以評估非小細(xì)胞肺癌中惡性腫瘤或免疫細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)水平。

多種實(shí)體瘤能夠通過表達(dá)PD-L1來形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境并躲避T細(xì)胞的殺傷作用，這些腫瘤包括黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、胸腺瘤、卵巢癌以及結(jié)直腸癌。腫瘤PD-L1過表達(dá)的患者可能預(yù)后較差，這也使得治療上要著重研究于PD-1/PD-L1靶線軸上[14-18]。隨著HER-2過表達(dá)腫瘤的靶向治療獲得突破，免疫組化來篩選PD-L1表達(dá)的腫瘤患者顯得尤為重要[19]。然而，無論是哪種腫瘤會對抗PD-1/PD-L1治療有效，還是哪些患者會從治療中受益，利用免疫組化檢測PD-L1已成為重要的問題。

目前發(fā)現(xiàn)過表達(dá)P D-L 1 的腫瘤比例范圍很廣，這是因?yàn)槭艿胶芏嘁蛩氐挠绊憽Ｄ壳霸撝委煂谏亓?、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌以及膀胱癌均有所效果，免疫組化表達(dá)PD-L1的范圍在14%～100%，這也表明PD-L1可以作為該治療的生物標(biāo)記物[20-21]。在血液腫瘤中，流式細(xì)胞儀檢測的腫瘤PD-L1表達(dá)范圍在37%～58%，這是因?yàn)镋BV與HTLV病毒引起的癌癥中PD-L1表達(dá)較高所致。與之相比，腫瘤組織學(xué)對檢測免疫檢查點(diǎn)不敏感，如結(jié)直腸癌與肉瘤，其檢出率在12%～53%，這也說明P D-L 1 免疫組化檢測不是決定P D-1/PD-L1表達(dá)情況的唯一手段[22]。

在結(jié)直腸癌中， 微小衛(wèi)星灶不穩(wěn)定型（MSI-H）腫瘤有較好的預(yù)后，這與腫瘤具有較高的T I L s 有關(guān)[23-24]。再者，與微小衛(wèi)星灶穩(wěn)定型（MSS）相比，MSI-H的結(jié)直腸癌具有較高的PD-L1表達(dá)水平（56% vs. 21%，P=0.007），這也預(yù)示著該類患者可能從PD-1/PD-L1 治療中獲益[25]。其中一種解釋是，MSI-H腫瘤缺少自身修復(fù)D N A 錯配的能力，突變的風(fēng)險(xiǎn)更高并能形成更多的新型抗原。這些新型抗原具有免疫原性，在MSI-H結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境中能夠提高腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（T I L s）水平[26]。再者，免疫抑制的腫瘤微環(huán)境由免疫檢查點(diǎn)過表達(dá)（如PD-L1）而形成。臨床試驗(yàn)方面，MSI-H結(jié)直腸癌免疫檢查點(diǎn)的抑制作用正在研究階段（N C T 0 2 0 6 0 1 8 8，NCT01876511）[27-28]。腫瘤的突變風(fēng)險(xiǎn)可能與免疫治療效果有關(guān)。從組織學(xué)來看，高突變風(fēng)險(xiǎn)（黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌與膀胱癌）也與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的療效有關(guān)，包括聯(lián)合治療[29-31]。這可能是因?yàn)榇罅康哪[瘤突變可能誘導(dǎo)出“高質(zhì)量”的免疫源性多肽，從而使檢查點(diǎn)抑制治療發(fā)揮出抗腫瘤的反應(yīng)[32]。

2 PD-L1 免疫組化技術(shù)問題

2017年5月5日，VENTANA PD-L1（SP263）檢測獲得CE認(rèn)證，作為抗PD-1治療KEYTRUDA的體外診斷檢測，檢測非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞膜中PD-L1的表達(dá)水平有助于識別適用pembrolizumab治療的患者。通過VENTANA PD-L1（SP263）檢測出腫瘤細(xì)胞膜中P D-L 1 的表達(dá)水平可能與nivolumab治療后生存期延長有關(guān)。目前PD-L1檢測仍然存在一些問題包括：檢測技術(shù)方面，如不同的檢測抗體、平臺以及不同的閾值的問題；生物學(xué)方面，如腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性；組織來源方面，如細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，存檔標(biāo)本與新鮮標(biāo)本，原發(fā)部位與轉(zhuǎn)移灶等。

人類腫瘤樣本的PD-L1免疫組化表達(dá)是受很多因素影響的?？梢岳枚喾N手段來檢測PD-L1免疫組化抗體，包括2 8-8，5 H 1，M I H 1 以及405.9A11。這些檢測手段的特征區(qū)別還不清楚。缺少對“陽性”腫瘤PD-L1免疫組化染色的明確定義是最大問題，其腫瘤細(xì)胞染色的臨界值確定范圍由1%～50%，無法統(tǒng)一。這與腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達(dá)的異質(zhì)性相關(guān)[33-34]。

再者，免疫組化抗體對PD-L1的結(jié)合位點(diǎn)較少，因?yàn)槠鋬H包含兩個小的疏水區(qū)域，而免疫組化常用的福爾馬林固定石蠟包埋方法（FFPE）效果較差[35-36]。由于缺少相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，免疫組化抗體必須選擇獨(dú)特的疏水位點(diǎn)來與PD-L1相結(jié)合。再者，PD-L1免疫組化的臨界值無法統(tǒng)一，PD-L1免疫組化檢測系統(tǒng)的多樣化，這些都成為了臨床研究生物標(biāo)記物的障礙。

目前PD-1/PD-L1抑制劑都有對應(yīng)的PD-L1檢測方法，但是每種檢測所用到的抗體和技術(shù)都不同，導(dǎo)致PD-L1表達(dá)水平的設(shè)定不同，同時對于不同的瘤種PD-L1表達(dá)水平的設(shè)定也不同。國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）在內(nèi)的多個國際組織都在努力推進(jìn)不同PD-L1表達(dá)檢測技術(shù)分析，以期能夠提供不同檢測間可靠的對比數(shù)據(jù)。

3 PD-L1 免疫組化生物學(xué)機(jī)理

從機(jī)制上講，僅在細(xì)胞膜上表達(dá)時，通過IFN-γ誘導(dǎo)或致癌基因激活，PD-L1才表現(xiàn)出生物學(xué)活性[37]。與炎癥引起的PD-L1表達(dá)不同，致癌基因介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)具有獨(dú)特的組織病理學(xué)與生物學(xué)特征。炎癥引起的PD-L1主要是通過IFN-γ介導(dǎo)的局部免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)，而致癌基因的PD-L1表達(dá)是整體彌散的。在炎癥反應(yīng)中的PD-L1作為適應(yīng)性免疫抗性的組成部分，往往與免疫反應(yīng)有關(guān)，而致癌基因介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)不存在免疫浸潤反應(yīng)[38-39]。大量的信號通路與組織學(xué)PD-L1表達(dá)有關(guān)。在結(jié)直腸癌中，PTEN的缺失或BRAF的過表達(dá)與PD-L1上調(diào)有關(guān)。激活A(yù)kt與RAS通路聯(lián)合PTEN缺失會導(dǎo)致免疫組化中PD-L1高水平表達(dá)，并降低體外T細(xì)胞的殺傷能力[39]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，siRNA下調(diào)PTEN會導(dǎo)致PD-L1過表達(dá)，與IFN-γ刺激無關(guān)[40]。值得注意的是，這些研究的PD-L1免疫組化染色顯示，在腫瘤中PD-L1呈彌散性分布，這與致癌基因介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)結(jié)果一致。PD-L1上調(diào)與PI3K、mTOR及MEK/ERK信號均相關(guān)，所以PD-L1的調(diào)控涉及很多信號通路，而不是單一的?？傊?，很多信號通路與PD-L1調(diào)節(jié)有關(guān)，這也說明靶向治療與免疫治療聯(lián)合用藥的必要性。

與致癌基因介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)相比，IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)是指動態(tài)的生物標(biāo)志物，并有明確的炎癥發(fā)生部位，在活檢樣品中可以發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境的具體情況。在腫瘤代謝微環(huán)境中，其他因素（如缺氧）能夠通過HIF1α誘導(dǎo)PD-L1上調(diào)[41-42]。PD-L1主要表達(dá)在腫瘤表達(dá)，與免疫細(xì)胞分泌的IFN-γ相結(jié)合。該假說是指PD-L1過表達(dá)可能是腫瘤在被TILs殺傷時起到的保護(hù)作用，并形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。這與PD-1的生物學(xué)特性相一致，T細(xì)胞的PD-1上調(diào)與T細(xì)胞活化有關(guān)。然而隨著時間的推移，PD-1過表達(dá)則是T細(xì)胞耗竭的標(biāo)志，可能是因?yàn)槠渌庖邫z查點(diǎn)的表達(dá)，如LAG-3、TIM-3等等。因此，PD-L1免疫組化的結(jié)果依賴于組織活檢的時間與是否接受過治療這兩方面。這就能夠解釋在黑色素瘤與卵巢癌中PD-L1表達(dá)與預(yù)后良好有關(guān)，而在其他組織中（如腎癌）則與預(yù)后較差有關(guān)[22,43-44]。

除了在時間的影響，腫瘤PD-L1的空間因素也需要考慮。很少有文章去比較原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間表達(dá)PD-L1的差別。原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移瘤的PD-L1表達(dá)量相近。然而，在結(jié)直腸癌中，33例樣本中 5例不一致，3例患者僅在原發(fā)瘤中表達(dá)PD-L1，而2例患者僅在轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)[45]。在接受PD-1/PD-L1治療后，目前這些患者的臨床緩解率仍未報(bào)道，但僅依靠PD-L1作為陰性生物標(biāo)記物來作為PD-1/PD-L1免疫治療的排除標(biāo)準(zhǔn)是不可取的。再者，是否選擇合適的病理部位進(jìn)行活檢也是需要考慮的。而在FFPE處理之前，原發(fā)性腫瘤標(biāo)本的直接檢測可能更具有意義。

4 PD-L1 免疫組化的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)

研究顯示，P D-L 1 的表達(dá)與P D-1/P D-L 1 抑制劑的療效相關(guān)。KEYNOTE-024研究結(jié)果也表明，PD-L1表達(dá)對pembrolizumab至關(guān)重要?；贙EYNOTE-024研究結(jié)果，F(xiàn)DA批準(zhǔn)對于PD-L1表達(dá)≥50%，且無明確驅(qū)動基因突變的初診的晚期非小細(xì)胞肺癌患者可以一線選擇pembrolizumab。目前，PD-L1檢測已經(jīng)寫進(jìn)了肺癌NCCN指南。此外，相關(guān)臨床試驗(yàn)的研究顯示在MSI-H的結(jié)直腸癌中，PD-L1的表達(dá)水平與患者使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效亦存在關(guān)聯(lián)。

對于結(jié)直腸癌而言，很多PD-1/PD-L1免疫治療正在進(jìn)行臨床研究階段。而很多臨床研究沒有報(bào)道，或正在申請PD-L1免疫組化作為診斷手段的專利，限制了PD-L1作為生物標(biāo)記物的數(shù)據(jù)。再者，免疫組化臨界值不同也影響其標(biāo)準(zhǔn)化的建立。盡管如此，目前研究數(shù)據(jù)表明，免疫組化PD-L1過表達(dá)與提高緩解率、無瘤生存率及總生存率有關(guān)。

基于對MSI-H腫瘤免疫原性腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識，以及抗P D-1 治療的顯著成效。在臨床試驗(yàn)中，10例MSI-H結(jié)直腸癌患者中，有4例（40%）達(dá)到了免疫相關(guān)的臨床緩解。免疫相關(guān)的緩解評估主要依賴于RECIST原則。利用PD-1抑制劑nivolumab對MSI-H腫瘤進(jìn)行了進(jìn)一步的臨床研究。70例MSI-H腫瘤患者在2周內(nèi)用nivolumab進(jìn)行治療。在最初的報(bào)告中，47例隨訪至少12周的患者中，12例（26%）達(dá)到了臨床緩解，平均達(dá)到緩解時間為2.12個月。另有14例（30%）患者達(dá)到病情穩(wěn)定，疾病控制率為55%。在美國臨床腫瘤學(xué)家協(xié)會（ASCO）GI癌癥研討會的后續(xù)報(bào)告中，緩解率（ORR）為31%，其中69%的患者通過評估達(dá)到了病情穩(wěn)定的效果。雖然該研究比pembrolizumab的治療效果要小，但這些結(jié)果表明該藥物能顯著改善患者病情。不同緩解率的原因尚不清楚，可能與患者人群的差異有關(guān)，而不是與藥物的療效不同有關(guān)。

與其他種類癌癥一樣，nivolumab和ipilimumab聯(lián)合應(yīng)用的臨床療效已得到肯定。在CheckMate 142中，nivolumab聯(lián)合ipilimumab給藥，隨后nivolumab單藥治療。30例患者中，27例可在中期分析中進(jìn)行評估。9例（33%）患者達(dá)到臨床緩解，14例（52%）患者病情達(dá)到穩(wěn)定，疾病控制率85%。聯(lián)合用藥方法似乎提供了更高的疾病控制的可能性，但會出現(xiàn)更多的3/4級免疫不良事件（AEs）?；谶@些數(shù)據(jù)，目前的NCCN指南已經(jīng)進(jìn)行了修改，將pembrolizumab與nivolumab均納入轉(zhuǎn)移性或不可切除的MSI-H結(jié)直腸癌的治療方案中。

在結(jié)直腸癌中，PD-L1陽性的患者似乎更對PD-1/PD-L1 免疫治療敏感?；谀壳坝邢薜臄?shù)據(jù)，MSI-H的結(jié)直腸癌中免疫組化高表達(dá)PD-L1對PD-1/PD-L1治療的緩解效果更為理想，但對于接受免疫治療PD-L1陰性的患者而言，其緩解與生存資料較少。然而，這方面研究仍需要大量樣本的大型臨床試驗(yàn)來證實(shí)。

PD-L1免疫組化作為預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用在很多臨床試驗(yàn)的癌癥組織檢測中。nivolumab的一期臨床研究包括了黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）以及轉(zhuǎn)移性去勢耐藥性前列腺癌（mCRPC）[46-48]。免疫組化應(yīng)用5H1抗體并且臨界值在5%，60%的腫瘤檢測為PD-L1陽性。PD-L1陽性的腫瘤緩解率達(dá)36%，而陰性的緩解率為0%。MPDL3280A試驗(yàn)應(yīng)用PD-L1免疫組化技術(shù)檢測了黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌與胃癌[49-52]。PD-L1陽性的患者緩解率達(dá)39%，而陰性的緩解率達(dá)13%。

5 總 結(jié)

免疫治療代表了多個方面腫瘤治療的范式轉(zhuǎn)變。雖然靶向治療改善了信號缺失所造成的腫瘤源性問題，但免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠直接調(diào)動患者先天性免疫系統(tǒng)達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)，由自身耐受轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑?xì)胞毒性，最終能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。隨著CTLA-4、PD-1與PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的誕生，人們又把目光放在宿主免疫系統(tǒng)上，而不是腫瘤內(nèi)部信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑。PD-L1過表達(dá)可能不是腫瘤源性的調(diào)控基因，但是能夠在微環(huán)境中保護(hù)腫瘤而不受免疫細(xì)胞的殺傷。

PD-L1過表達(dá)的患者對抗PD-L1藥物更為敏感。因此，PD-L1免疫組化可能并不能成為有效的生物標(biāo)志物。很少有生物標(biāo)志物能代表兩個變量。例如，一名患者檢測其中一種生物標(biāo)記物，但患者接受相應(yīng)的治療后并未得到緩解，這是因?yàn)槔^發(fā)的生物學(xué)或分子改變使得腫瘤繼續(xù)生長。相似的是，生物標(biāo)志物檢測為陰性的患者可能會從相應(yīng)的治療中獲益，這是因?yàn)榛罨纳飳W(xué)通路可能相互作用，從而激活了其他的信號通路。技術(shù)方法因素與臨界值的選取標(biāo)準(zhǔn)也可能影響生物標(biāo)記物的應(yīng)用。總之，很少的生物標(biāo)記物能夠明確界定其臨界值，人們只能通過統(tǒng)計(jì)學(xué)手段來評估其臨床的應(yīng)用價值，從而使患者受益。