趙 澄，盧芳國

(湖南中醫(yī)藥大學 1. 中西醫(yī)結合學院； 2. 醫(yī)學院，湖南 長沙 410208)

冠狀病毒最先于1937年從雞身上分離出來，1965年從普通感冒患者鼻洗液中分離出，并相繼從人胚腎細胞和人胚氣管中分離。1975年由國際病毒命名委員會正式命名為冠狀病毒科[1]。根據(jù)血清學特性及基因序列的差異，分為α、β、γ、δ四屬，其中α、β兩屬僅感染哺乳動物，另外兩屬表現(xiàn)為禽類易感。冠狀病毒在人類和動物群體中廣泛分布，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。普通型冠狀病毒感染常呈現(xiàn)流涕、不適等感冒癥狀，癥狀輕微，具有自限性[2]。而高致病性冠狀病毒侵襲人體，則表現(xiàn)為嚴重呼吸道癥狀，全身多器官受累甚至死亡。近年高致病冠狀病毒多次肆虐全球，其中，包括2002年冬至2003年春流行的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respirator syndrome coronavirus, SARS-CoV)、2012年流行的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)以及2019年冬至今流行的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)[3-4]。目前，對于高致病性冠狀病毒，尚無特效藥治療，疫苗也還處于研發(fā)階段。據(jù)此，本文從病毒基因結構的特點出發(fā)，探析高致病性冠狀病毒的致病機制，為高致病性冠狀病毒感染的預防和治療提供參考。

1 冠狀病毒基因結構的一般特點

冠狀病毒是已知基因組最大的單股正鏈RNA病毒，基因組長約27～32 kb，由6～11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)組成[5]，編碼非結構蛋白(nsp)、結構蛋白以及特異性輔助蛋白。其中，基因組5’端的三分之二序列屬于ORF1，編碼兩個大的多聚蛋白pp1a和pp1ab，由病毒nsp3編碼的木瓜蛋白酶結構域和nsp5的3C樣蛋白酶分別識別切割nsp1-4和nsp4-16區(qū)域位點，形成16個非結構蛋白nsp，負責病毒的轉(zhuǎn)錄和復制[6]。基因組3’端的三分之一序列編碼四種主要結構蛋白及輔助蛋白，按S(刺突蛋白)-E(包膜蛋白)-M(膜蛋白)-N(核衣殼蛋白)-3’端的順序排列，輔助蛋白基因散布其間，共同介導入侵宿主細胞、參與病毒生命全周期以及致病過程[7]。

大基因結構的特性在適應和修飾基因方面賦予冠狀病毒較大的可塑性[8]，因而冠狀病毒基因的重組率高，易出現(xiàn)變異和進化。目前，已發(fā)現(xiàn)七種可以感染人類的冠狀病毒，其中SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2為高致病性冠狀病毒，皆為β屬冠狀病毒[3]。研究者通過對病毒全基因組核苷酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)這三種高致病性冠狀病毒基因序列相似，其中SARS-CoV-2與SARS-CoV、MERS-CoV基因組序列同源性分別為79%和50%[9]，序列差異主要在編碼pp1a和S蛋白的基因上[10]。追溯高致病性冠狀病毒的來源，研究者通過對SARS-CoV-2與Bat-CoV RaTG13的基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)兩者相似度達96%[11]，而SARS-CoV與蝙蝠冠狀病毒同源性有87%～92%[12]，說明體內(nèi)攜帶多種病毒的蝙蝠可能是高致病性冠狀病毒的天然宿主，是研究和防控的重點[13]。

2 SARS-CoV基因結構特點及致病機制

SARS-CoV基因組長約29.7 kb，含有14個ORF，5’端和3’端有長約265 bp和342 bp的非翻譯區(qū)，從5’端到3’端依次有ORF1a-ORF1b-ORF2-ORF4-ORF5-ORF9a編碼兩個多蛋白和S、E、M、N四個結構蛋白。另外還有八個特有基因(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b和ORF9b)排列于ORF2和ORF9a之間，編碼輔助蛋白[14]。 這些基因編碼的蛋白在SARS-CoV的致病過程中發(fā)揮重要作用。病毒增殖是其致病的基礎，病毒增殖過程包括：吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放。病毒對宿主細胞的吸附是病毒增殖的第一環(huán)節(jié)。ORF2編碼的S蛋白中S1亞基受體結合域(RBD)通過與宿主細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)受體結合，介導吸附；S2亞基隨之發(fā)生構象改變，介導病毒包膜與宿主包膜融合，從而使病毒穿入宿主細胞中。ORF1a和ORF1b編碼的非結構蛋白，組裝成復制酶-轉(zhuǎn)錄酶復合物以及其他病毒復制所需酶類，負責病毒的轉(zhuǎn)錄和復制。ORF4、ORF5、ORF9a編碼的E、M、N三個結構蛋白則參與SARS-CoV增殖過程的裝配和釋放。另外，ORF3a和ORF7a編碼的3a和7a蛋白與S、M蛋白相互作用，參與病毒的吸附、裝配和釋放[15]。

ACE2是SARS-CoV與宿主細胞結合的主要受體之一[16]，由于其廣泛表達于肺泡上皮細胞、氣管、支氣管、支氣管漿液腺、肺泡單核細胞、巨噬細胞以及腎、心、大腦等組織中[17-18]，因此，SARS患者常表現(xiàn)為多組織多器官損傷。臨床尸檢報告發(fā)現(xiàn)，SARS患者除有彌漫性肺泡損傷、水腫、透明膜形成、組織纖維化及巨噬細胞、淋巴細胞浸潤等肺部特征表現(xiàn)外，有三分之一以上的病例伴有急性腎小管損傷、心肌纖維水腫、脾萎縮以及淋巴細胞減少，少數(shù)病例還出現(xiàn)神經(jīng)元水腫變性、腹瀉等消化道癥狀[19-22]。

SARS-CoV的致病機制還與過度的免疫應答觸發(fā)免疫病理損傷有關，其中包括單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞浸潤增加，促炎細胞因子和趨化因子失調(diào)等[23-24]。特有基因編碼的輔助蛋白在此過程發(fā)揮關鍵作用。其中3a和7a蛋白不僅能夠激活NF-κB和JNK通路，上調(diào)促炎因子和趨化因子的表達，從而誘導免疫炎癥反應的發(fā)生；還具有誘導宿主細胞凋亡、使細胞周期停滯等作用[15, 25]。3b和6蛋白有干擾素拮抗的作用，可通過不同機制抑制干擾素活性，對抗機體的抗病毒作用[26]。有學者對14例臨床確診SARS患者的細胞因子進行分析，發(fā)現(xiàn)患者早期血清中γ-干擾素誘導型蛋白10(IP-10)，白介素-2(IL-2)和IL-6的水平顯著升高，同時發(fā)現(xiàn)干擾素γ(IFN-γ)誘導的IL-8和IL-10水平升高[27]，在其他重癥患者中，也發(fā)現(xiàn)IL-6水平比輕癥患者高[28]，因此，說明輔助蛋白誘導的干擾素過度表達，可能是SARS-CoV感染患者后期出現(xiàn)免疫病理損傷的重要原因[29]。

3 MERS-CoV基因結構特點及致病機制

MERS-CoV基因組全長約30 kb，由10個ORF組成。具有冠狀病毒的一般特性，即5’端為ORF1a和ORF1b兩個大的開放閱讀框，編碼16個非結構蛋白(nsps)；3’端的ORF2、6、7、8編碼S、E、M、N四個典型的結構蛋白。其特有的基因為ORF3，ORF4a，ORF4b和ORF5[30]。與SARS-CoV相似，MERS-CoV致病的第一環(huán)節(jié)由ORF2編碼的S蛋白介導。不同的是，S1亞基需要雙肽肽酶4(DPP4，又稱CD26)作為其宿主細胞受體實現(xiàn)吸附[31]，才能觸發(fā)S2亞基的構象變化達到入侵目的。值得注意的是，ORF6、7、8編碼的結構蛋白(E、M、N)、ORF1a、1b編碼的非結構蛋白(nsp1、nsp4、nsp6、nsp8、nsp12、nsp13、nsp16)以及ORF3、4a輔助蛋白(3、4a)廣泛參與病毒增殖過程中的生物合成、組裝和釋放[32]。

DPP4是一種多功能的細胞表面蛋白，廣泛表達于腎、小腸、肝、前列腺的上皮細胞和活化的白細胞上，在呼吸道中，主要表達在肺泡上皮細胞，而在鼻腔和支氣管則無表達[33]。這一分布特性在感染模型中得到充分體現(xiàn)。MERS-CoV動物感染模型中肺部有中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，同時伴有肺泡水腫[32]。而腎由于DPP4受體的高表達，MERS-CoV感染通過直接損傷或缺氧損傷引起腎功能障礙[34]。Assiri等[35]通過對47例臨床確診MERS患者進行觀察，發(fā)現(xiàn)所有患者胸部X片出現(xiàn)異常，98%的患者出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，超過70%的患者出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促等肺炎表現(xiàn)，20%左右的患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等胃腸道表現(xiàn)。另外，重癥MERS患者92%具有休克、急性腎損傷及血小板減少等肺外表現(xiàn)[36]?？梢?，MERS-CoV感染患者的臨床表現(xiàn)與病毒增殖過程中第一階段(吸附)所需要的輔助蛋白(DPP4)的分布關系密切。另外，DPP4作為T細胞活化和T細胞免疫應答共刺激信號的關鍵因子，其大量表達也與MERS-CoV的致病密切相關[32]。

宿主免疫功能失調(diào)是MERS-CoV的另一致病機制。一方面，MERS-CoV通過感染人類巨噬細胞和樹突狀細胞，幫助病毒直接破壞宿主免疫系統(tǒng)，誘導細胞因子和趨化因子失調(diào)，引起宿主IFN-γ、IP-10、IL-8、IL-12、CCL-2、CCL-3、CCL-5、MHC-II類(HLA-DR)和共刺激分子CD86表達升高，這些細胞因子的促炎和過度免疫作用，可引起宿主嚴重炎癥和組織損傷[37-38]。另一方面，其基因編碼的輔助蛋白通過干擾宿主的免疫應答而實現(xiàn)其致病作用。如輔助蛋白4a、4b、5以及結構蛋白M是有效的干擾素(IFN)拮抗劑，抑制IFN的產(chǎn)生和其應答元件的信號傳導，從而逃避宿主的抗病毒作用[39]；4b和5蛋白還可以干擾NF-κB介導的先天免疫反應，影響宿主炎癥因子的表達，減輕對病毒的損傷[40]；蛋白激酶R(PKR)介導的應激反應也是重要的先天免疫反應之一，4a蛋白阻止了dsRNA介導的PKR激活，從而拯救了翻譯抑制并防止了應激顆粒的形成，確保病毒轉(zhuǎn)錄和復制[41]。

4 SARS-CoV-2基因結構特點及致病機制

SARS-CoV-2(NC_045512.2)基因組長約29.9 kb，具有編碼12種蛋白的11個ORFs，與SARS-CoV和MERS-CoV類似的是SARS-CoV-2具有典型的5’端和3’端基因結構，編碼非結構蛋白和結構蛋白，同時3’端還有編碼六個輔助蛋白(3a、6、7a、7b、8和10)的特有基因。與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2的ORF1ab中7個保守復制酶結構域的氨基酸序列具有94.4%的同一性，但是其總氨基酸序列存在380個替換，其中nsp3和nsp2中分別有102和61個氨基酸替換，S蛋白存在27個氨基酸替換，與之同源性約為75%[3,42]，這些差異是否會影響SARS-CoV-2的宿主傾向和傳播特性尚需進一步研究。

SARS-CoV-2與SARS-CoV具有相同的吸附、穿入機制，即通過ORF2編碼的S蛋白與宿主細胞ACE2受體結合，并與宿主蛋白酶主要是跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)協(xié)同作用，促進病毒穿入宿主細胞[43]。與SARS-CoV和MERS-CoV類似的是，SARS-CoV-2基因編碼的蛋白廣泛參與病毒增殖及致病過程。ORF1a和ORF1ab編碼的非結構蛋白nsp7和nsp8形成異二聚體刺激nsp12(RNA依賴性RNA聚合酶)的合成，促進病毒增殖；nsp10、nsp13、nsp14、nsp16共同參與5’端甲基化帽形成，保證mRNA的輸出，保護病毒免受宿主先天免疫反應；nsp8、nsp13和ORF5編碼的M蛋白促進病毒感染期間高爾基體重構；nsp2、nsp6、nsp7、nsp10以及ORF4編碼的E蛋白和ORF3a編碼的3a蛋白修飾內(nèi)膜區(qū)室促進病毒復制[44-46]；nsp3則是病毒釋放所必須的蛋白。

SARS-CoV-2的致病機制與S蛋白及其受體ACE2緊密聯(lián)系。在病毒吸附、穿入環(huán)節(jié)，與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2能力更強，這是因為其S蛋白受體結合結構域氨基酸序列發(fā)生突變，產(chǎn)生的Q493和P499氨基酸殘基與ACE2受體結合更穩(wěn)定[47-48]。另外，由于ACE2受體在肺部高水平表達，當SARS-CoV-2入侵宿主與其結合后，會下調(diào)ACE2水平而不影響ACE，造成肺內(nèi)ACE2和ACE失衡[49]，血管緊張素Ⅱ水平升高，過度激活肺部血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor，AT1R)，導致肺部毛細血管通透性增加[50]，引發(fā)肺水腫，進一步損害肺功能，繼而可導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2表達水平在人群中男性高于女性，老年男性患者更容易出現(xiàn)合并癥[51]。因此，ACE2受體作為SARS-CoV-2致病的重要一環(huán)，是疫苗開發(fā)的可考慮途徑。

“細胞因子風暴”所引發(fā)的免疫病理損傷是SARS-CoV-2致病機制的重要環(huán)節(jié)。研究者經(jīng)過冷凍電鏡觀察，SARS-CoV-2的ORF2編碼的S蛋白三聚體結構相對緊湊，通過多糖屏蔽表位，幫助病毒實現(xiàn)免疫逃避[47]。SARS-CoV-2雖然可抑制IFN-I等干擾素的表達，但是IL-6、IL-8、CCL-2等炎癥因子和趨化因子不受影響的升高，吸引更多的白細胞聚集，加速“細胞因子風暴”的發(fā)生[52]。其具體作用基因尚不明確，需進一步研究。相關臨床報道也證實了“細胞因子風暴”的作用，研究者對首批41例確診新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疾病住院患者血清炎癥因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)重癥監(jiān)護病房(ICU)的重癥患者有更高水平的GCSF、IP10、MCP1、MIP1A和TNFα，說明“細胞因子風暴”可能是SARS-CoV-2感染患者由輕癥向危重癥轉(zhuǎn)化及危重患者死亡的重要原因[53]。另外，有學者對463例COVID-19患者進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)重癥患者的總淋巴細胞、CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量減少，說明SARS-CoV-2可對人淋巴細胞施加重擊，導致致命性肺炎[54]。這些致病機制與病毒基因所編碼蛋白特性有關。

5 總結與展望

三種高致病性冠狀病毒的基因結構和致病機制有相似之處，除了編碼相似的結構蛋白和非結構蛋白外，還分別編碼特有的輔助蛋白，共同在侵襲宿主的過程中發(fā)揮重要作用。一方面，介導病毒入侵宿主細胞，并迅速組裝、釋放病毒顆粒，直接損傷宿主細胞；另一方面，介導宿主的免疫應答，攻擊宿主免疫細胞，干擾先天免疫應答，實現(xiàn)免疫逃逸，同時，病毒蛋白還可通過上調(diào)宿主炎癥因子和趨化因子的表達水平造成組織免疫病理損傷。因此，關于高致病性冠狀病毒感染的防治，可以針對起相關作用的病毒基因及其編碼的蛋白開發(fā)相應藥物，如：S蛋白受體拮抗劑、nsp3靶向抑制劑、特異性輔助蛋白抑制劑等，通過抑制病毒的增殖，減輕對宿主免疫應答的影響而達到防治目的。另外，除了病毒的攻擊外，宿主的免疫應答在高致病性冠狀病毒疾病的發(fā)展過程中也扮演著重要的角色，在此類感染性疾病中，老年人和有慢性基礎疾病者病死率高，因此，盡早進行免疫治療，也是應關注重點之一。