胡彥兵 馬海鴻 鄭永濤 徐 鋒

Forsen和Hoffman兩位學(xué)者首次采用雙共振核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）方法開放地檢測到化學(xué)交換的中間產(chǎn)物，并就此開辟了新領(lǐng)域——化學(xué)飽和交換轉(zhuǎn)移（chemical exchange saturation transfer， CEST），這是一個(gè)測量稀釋大分子物質(zhì)之間的化學(xué)交換和化學(xué)動(dòng)力學(xué)的敏感方法[1-2]。CEST可以行多種化合物（葡萄糖、糖原、乳酸鹽）、蛋白質(zhì)和酶的分子成像。CEST成像不僅對(duì)不穩(wěn)定的質(zhì)子濃度、交換速率、pH和溫度敏感，還受到弛豫率、場強(qiáng)、射頻功率、成像參數(shù)等因素的影響。發(fā)展外源性CEST試劑，包括順磁性CEST試劑和逆磁性CEST試劑可以極大地提高CEST成像的敏感度。此外，CEST成像能夠應(yīng)用于干細(xì)胞示蹤，腫瘤細(xì)胞追蹤，測定pH、溫度、體內(nèi)酶活性和組織代謝等[3-11]。此文對(duì)CEST成像在生物工程中的應(yīng)用作一綜述。

EST對(duì)比劑分類

CEST是一類陰性磁共振成像對(duì)比劑，通過轉(zhuǎn)移飽和質(zhì)子達(dá)到減低水質(zhì)子的信號(hào)而產(chǎn)生陰性對(duì)比。與傳統(tǒng)的T1或者T2磁共振對(duì)比劑不同的是，CEST對(duì)比劑具有很高的敏感性和特異性，而且它可以通過特定的刺激開啟，如pH、溫度和飽和脈沖等[12-14]。目前研究中使用的CEST對(duì)比劑基本可以分為三種類型：①順磁性CEST試劑，這類對(duì)比劑主要是以鑭系元素為核心合成的對(duì)比劑，敏感性比較高[15-16]。鑭系元素往往具有毒性，因此目前這類對(duì)比劑多用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中；②逆磁性CEST對(duì)比劑，主要是包括酰胺基、胺基或者羥基的小分子化合物，如糖原、蛋白質(zhì)、多肽等，敏感性稍低[17]。這類對(duì)比劑多是天然存在的或者人體本身具有的化合物，因此有望廣泛應(yīng)用于臨床。更重要的是，由于某些大分子物質(zhì)就存在于人體內(nèi)，可以作為內(nèi)源性對(duì)比劑，更加安全和方便。③新型合成對(duì)比劑，如脂質(zhì)體、多聚賴氨酸、介孔二氧化硅等。這類對(duì)比劑由于本身含有較多的可交換不穩(wěn)定質(zhì)子群，也具有比較高的敏感度，而且其本身是利用有機(jī)物合成的，不含毒性，因此有更為廣闊的應(yīng)用前景[18-20]。

CEST對(duì)比劑的應(yīng)用

1.干細(xì)胞示蹤

干細(xì)胞移植治療多種疾病已經(jīng)得到了全世界范圍內(nèi)的關(guān)注，并且已經(jīng)得到了臨床方面的應(yīng)用。2017年，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》雜志同時(shí)報(bào)道了世界上兩個(gè)不同中心應(yīng)用干細(xì)胞移植治療視神經(jīng)病變，雖然目前療效仍不穩(wěn)定，但是為這些難治性疾病提供了可能的解決方案[21-22]。然而，在干細(xì)胞移植治療應(yīng)用于臨床前，必須建立無創(chuàng)性的體外示蹤方法去示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、分布、功能重建等。盡管磁共振技術(shù)和PET等技術(shù)已經(jīng)為干細(xì)胞示蹤提供了很多途徑，這些技術(shù)仍有其自身難以克服的缺點(diǎn)，如示蹤劑的生物毒作用、難以長期示蹤等，CEST技術(shù)則為干細(xì)胞示蹤提供了一個(gè)新的思路。Pumphrey研究組[23]將Eu-HP-DO3A標(biāo)記的心肌干細(xì)胞分別移植到實(shí)驗(yàn)組（同種系小鼠）和對(duì)照組（異種系小鼠），并在移植后持續(xù)使用MRI示蹤20天，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組持續(xù)檢測到CEST信號(hào)，而對(duì)照組的CEST信號(hào)逐漸消失。順磁性CEST試劑主要是通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此需要在移植前將對(duì)比劑與移植細(xì)胞共培養(yǎng)。與常規(guī)MRI示蹤技術(shù)不同的是，CEST-MRI可以根據(jù)示蹤劑分子的不同選擇不同的預(yù)飽和脈沖，因此可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)示蹤兩種不同的細(xì)胞。在Nicholls等[24]的研究中，他們分別使用Yb-HP-DO3A和Eu-HPDO3A標(biāo)記移植的內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞，然后移植到卒中小鼠模型腦內(nèi)，通過使用不同的預(yù)飽和脈沖，可以同時(shí)示蹤到這兩種細(xì)胞。雖然使用順磁性CEST試劑標(biāo)記移植細(xì)胞具有很高的敏感性，但鑭系金屬的毒性限制了它在臨床上的使用，因此我們應(yīng)該開發(fā)更多的逆磁性CEST試劑標(biāo)記干細(xì)胞的方法和技術(shù)，以期早日實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的臨床應(yīng)用。

2. pH 的測定

由于交換速率與組織微環(huán)境的pH直接相關(guān)，CEST效應(yīng)對(duì)pH變化敏感，因此CEST技術(shù)被用于檢測體內(nèi)pH。腫瘤灶內(nèi)常有細(xì)胞缺血壞死，且腫瘤細(xì)胞糖代謝紊亂，pH不同于正常細(xì)胞。惡性腫瘤的細(xì)胞外pH明顯低于周圍正常組織，因此檢測pH對(duì)于腫瘤性質(zhì)的判定具有重要意義。特別是在某些低級(jí)別腫瘤中，常規(guī)的磁共振很難將其與炎癥等疾病區(qū)別開來，CEST技術(shù)通過測定pH有助于腫瘤性質(zhì)的判斷。Yb-HP-DO3A是一種順磁性CEST對(duì)比劑，其上的兩個(gè)羥基可以產(chǎn)生CEST效應(yīng)，通過數(shù)學(xué)公式換算，可以得到其CEST效應(yīng)和一定范圍內(nèi)的pH呈線性相關(guān)關(guān)系[15]。然而，這個(gè)pH范圍通常位于5.2～6.7，而一般腫瘤的pH多位于6.4～7.2之間，因此使用價(jià)值有限。碘帕醇是一種臨床常用的CT顯影劑，作為順磁性CEST試劑，碘帕醇也可以用來測定體內(nèi)pH。碘帕醇具有兩個(gè)可轉(zhuǎn)移的質(zhì)子，其預(yù)飽和脈沖分別是4.3ppm和5.5ppm，因此，在同一時(shí)間內(nèi)可以分別施加不同的預(yù)飽和脈沖，然后通過數(shù)學(xué)計(jì)算公式，消除濃度等其他方面的影響，定量檢測體內(nèi)pH。目前研究發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)（5.5～7.5），碘帕醇的CEST效應(yīng)和pH呈線性相關(guān)關(guān)系，可以用于腫瘤的輔助診斷[17，25]。有學(xué)者通過將CEST-MRI和PET聯(lián)合應(yīng)用，證實(shí)了CEST-MRI探測到的低pH 區(qū)域確實(shí)存在高代謝情況[26]。

除了探測腫瘤的pH外，CEST技術(shù)還可以通過檢測移植細(xì)胞的pH用于判斷示蹤干細(xì)胞移植后存活狀態(tài)。細(xì)胞的存活與局部微環(huán)境pH密切相關(guān)，因此我們可以通過檢測移植細(xì)胞微環(huán)境的pH判斷細(xì)胞的存活狀態(tài)。Chan等[18]利用具有CEST效應(yīng)的賴氨酸構(gòu)建了一個(gè)脂質(zhì)微囊，在微囊內(nèi)部注入干細(xì)胞，即刻檢測pH在正常范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞的凋亡，pH出現(xiàn)降低。Ni等[19]將金屬鎘離子和賴氨酸有機(jī)結(jié)合起來，構(gòu)建了一個(gè)既能在T1顯像又具有CEST效應(yīng)的納米微粒，該微粒不僅可以提供移植細(xì)胞的位置分布，還能同時(shí)探測pH。CEST的pH成像技術(shù)在腦卒中方面也顯示了很好的應(yīng)用前景，急性期或超急性期pH-MRI可反映核心壞死區(qū)和半暗帶區(qū)域的pH，提供更為準(zhǔn)確的半暗帶區(qū)域。不僅能夠幫助探討更深入的分子機(jī)制，還可用于指導(dǎo)腦卒中臨床治療和預(yù)后評(píng)價(jià)。

3. 溫度的測定

溫度也是機(jī)體代謝的一個(gè)重要參數(shù)，和人體的代謝、酶的活性密切相關(guān)。既往研究已報(bào)道利用磁共振無創(chuàng)性探測體內(nèi)溫度，最常用的方法是利用溫度和磁共振T1弛豫時(shí)間，化學(xué)位移或者自由水的擴(kuò)散系數(shù)之間的關(guān)系。然而，這種方法的低靈敏度限制了它的應(yīng)用。因而，有研究報(bào)道利用順磁性CEST試劑的MRI效應(yīng)與溫度的關(guān)系來探測溫度。順磁性CEST試劑上的酰胺質(zhì)子和自由水的質(zhì)子之間的轉(zhuǎn)移是溫度依賴性的，而且對(duì)溫度變化非常敏感，因此我們可以使用CEST-MRI無創(chuàng)性檢測體內(nèi)溫度[13，27]。Nevin等[13]發(fā)現(xiàn)在pH6.0～8.0范圍內(nèi)，Tm3+-DOTAM上的酰胺質(zhì)子和自由水質(zhì)子之間的轉(zhuǎn)移速率和溫度成線性相關(guān)關(guān)系，而且探測敏感度較高。使用一定的數(shù)學(xué)方法以后，可以得到CEST效應(yīng)和溫度的曲線關(guān)系。

4. 體內(nèi)酶活性測定

利用CEST技術(shù)測定酶的活性的原理是酶可以改變CEST試劑的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)或者降低CEST效應(yīng)，造成可探測到的CEST-MRI的改變。目前可以利用的有兩個(gè)方面。一是CEST對(duì)比劑注入生物體內(nèi)后，通過在體外檢測CEST信號(hào)的改變來反應(yīng)酶的活性。Liu等[28]提出了一個(gè)在體外檢測胞嘧啶脫氨酶（CDase）的活性的CEST-MRI方法，該酶是催化胞嘧啶脫氨酸尿嘧啶的酶。他們的研究結(jié)果表明，胞嘧啶脫氨酶的兩個(gè)底物，胞嘧啶和5-氟胞嘧啶（5FC）可以分別使用+2ppm和+2.4ppm（相對(duì)于水）的預(yù)飽和脈沖來檢測。在這兩個(gè)代謝底物被胞嘧啶脫氨酶脫氨后，CEST效應(yīng)就會(huì)消失。因此，可以用高分辨率CEST-MRI成像在體外檢測胞嘧啶脫氨酶的活性。CEST-MRI有可能在活組織中實(shí)時(shí)跟蹤多種酶的動(dòng)力學(xué)。二是檢測移植細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)。將報(bào)告基因通過病毒轉(zhuǎn)染的方式插入移植細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)報(bào)告基因在受體內(nèi)表達(dá)酶時(shí)，通過檢測底物的CEST效應(yīng)的改變來間接反映該報(bào)告基因的表達(dá)情況[21]。

5. 組織代謝的測定

葡萄糖是生物體代謝和維持生命活動(dòng)最主要的功能物質(zhì)，葡萄糖代謝異常會(huì)引起多種疾病。此外，腫瘤組織的葡萄糖代謝也與正常組織不同，因此檢測葡萄糖在體內(nèi)的分布有助于判斷生物體的代謝狀況。Zhang等[20]利用苯基硼酸可以和羥基可逆性結(jié)合的特點(diǎn)將CEST試劑(EuDTMA-2PB3+)結(jié)合在了葡萄糖上面，通過在體外利用MRI檢測EuDTMA-2PB3+的CEST效應(yīng)和峰值變化，就可以得知葡萄糖在體內(nèi)的代謝狀況。同樣，Ren等[31]學(xué)者將連接了EuDTMA-2PB3+的葡萄糖和EuDTMA-2PB3+分別注射到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，在體外施加42ppm的預(yù)飽和脈沖以后，MRI檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的CEST信號(hào)較對(duì)照組下降了17%。這說明該方法可以用于檢測葡萄糖在體內(nèi)的分布。

總結(jié)和展望

綜上所述，與常規(guī)T1、T2 MRI不同的是，CEST-MRI具有較高的敏感性、對(duì)比劑廣泛、不僅可以示蹤位置還可以示蹤功能等優(yōu)點(diǎn)，這使得CEST-MRI具有較大臨床應(yīng)用前景。但是目前還有一些問題需要解決：①外源性對(duì)比劑較內(nèi)源性對(duì)比劑有著更高的敏感度性，但是其生物毒性仍然是限制其使用的重要原因；②在以后的工作中，應(yīng)該進(jìn)一步完善相關(guān)序列的設(shè)置，使得CEST技術(shù)應(yīng)用更加方便；③雖然CEST技術(shù)可以在體外檢測體內(nèi)的pH、溫度等，但是需要進(jìn)行嚴(yán)格的數(shù)學(xué)計(jì)算，因此優(yōu)化數(shù)學(xué)模型至關(guān)重要。相信隨著研究的深入和更多CEST對(duì)比劑的開發(fā)，CEST技術(shù)一定會(huì)在臨床上有更大的應(yīng)用前景。