馬 帥，李金積，趙 明，王 媛，劉樞清，李 超

（1.青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266100；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266114；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡稱布病，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人獸共患傳染病，以發(fā)熱和流產(chǎn)為主要特征，流行于170 多個國家和地區(qū)[1]，對畜牧業(yè)發(fā)展和人畜健康構(gòu)成較大威脅[2]，我國將其列為二類動物疫病。本文重點介紹布病的病原學(xué)、流行病學(xué)，及診斷技術(shù)和疫苗的研究進展，旨在為布病的防控政策和凈化措施的制定、新的診斷技術(shù)和疫苗的開發(fā)提供參考。

1 病原學(xué)

布魯氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧菌，屬兼性胞內(nèi)病原體[3]。根據(jù)其生化特性、抗原成分、宿主特異性和對宿主致病性將布魯氏菌分為10個種，包括羊種布魯氏菌、綿羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌、犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌、田鼠種布魯氏菌、鯨種布魯氏菌、鰭種布魯氏菌以及從人類乳腺中分離到的人布魯氏菌[4-6]。

羊種、綿羊種、牛種、豬種、犬種和鼠種布魯氏菌為經(jīng)典種，共有20個生物型，即羊種布魯氏菌（3個生物型），綿羊種布魯氏菌，牛種布魯氏菌（9個生物型），豬種布魯氏菌（5個生物型），犬種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌各1個生物型[7]。經(jīng)典種中羊種布魯氏菌對人類的感染性最強[5]。布魯氏菌對外界環(huán)境抵抗力較強，但對熱和一般化學(xué)消毒藥比較敏感。

2 流行病學(xué)

布病主要流行于中東、拉丁美洲、亞洲、非洲和地中海盆地等牛羊養(yǎng)殖集中但經(jīng)濟技術(shù)相對落后的地區(qū)[8]，每年約有50 萬新發(fā)人間病例，造成的經(jīng)濟損失約30 億美元[9-10]。2004—2015年，我國家畜布病發(fā)病率居高不下，發(fā)病家畜主要以綿羊和牛為主，發(fā)病數(shù)量較多的省份有內(nèi)蒙古、新疆、陜西、山西、湖北、山東和黑龍江等，其中內(nèi)蒙古最為嚴重[2]。

近年來，隨著我國家畜飼養(yǎng)量的增加，人間布病發(fā)病數(shù)呈快速上升趨勢[11]。據(jù)國家衛(wèi)健委官網(wǎng)信息，2019年1—10 月我國共報告布病發(fā)病40 743 例，死亡1 例，國內(nèi)布病發(fā)病總數(shù)已超2018年全年。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生計生委印發(fā)了《國家布魯氏菌病防治計劃（2016—2020年）》，為布病防控確立了目標并制定了原則和策略，不斷推進全國布病防治、監(jiān)測和凈化，但受疫源分布廣、活畜流動性大、基層防疫體系薄弱、淘汰病畜難度大、防治經(jīng)費投入不足等因素影響，我國布病疫情仍然嚴重，防控形勢十分嚴峻[9]。

布病的傳染源主要是患病動物和帶菌者（包括野生動物），此外被布魯氏菌污染的土壤、水源、病畜肉以及乳汁都可造成人畜的感染[12-13]。本病的易感動物范圍廣泛，主要包括羊、牛、豬、犬、馬、鹿、駱駝和鼠等，同時人也易感；傳播途徑主要包括皮膚黏膜、消化道、呼吸道等。本病潛伏期短則一周，長則數(shù)月甚至半年以上[14-15]。感染本病的母畜主要臨床癥狀為妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、弱胎或死胎[16]；感染公畜臨床表現(xiàn)為睪丸炎、附睪炎和運動障礙[5]；人感染布病的潛伏期為2 周左右，初期癥狀與流感類似，主要表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、多汗、無力和關(guān)節(jié)疼痛等，后期可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，嚴重者喪失勞動能力[17-18]。

3 診斷技術(shù)研究進展

3.1 細菌學(xué)診斷技術(shù)

布魯氏菌的分離培養(yǎng)是診斷布病的最基礎(chǔ)方法，也是檢測布病的“金標準”[19]。但由于布魯氏菌對環(huán)境和營養(yǎng)要求較高，還受動物感染階段、樣本中病原體數(shù)量及檢測前抗生素使用等因素影響，常導(dǎo)致細菌污染，不能及時做出診斷而使病情加重[20-22]。

布魯氏菌的分離培養(yǎng)操作過程復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員在生物安全三級以上實驗室操作[23]，分離操作過程存在較高的生物安全風(fēng)險。因此，布魯氏菌的分離培養(yǎng)一般不用于現(xiàn)場疫情的篩查和臨床快速檢測[5，24]，僅用于個別動物的輔助診斷和流行病學(xué)追蹤調(diào)查等[5，12，25]。

3.2 血清學(xué)診斷技術(shù)

目前布病的血清學(xué)檢測種類較多，但在國際上尚未有標準方法，常用的有常規(guī)血清學(xué)試驗、補體結(jié)合試驗（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和熒光偏振試驗（FPA）等。

3.2.1 常規(guī)血清學(xué)診斷技術(shù) 試管凝集試驗（SAT）、虎紅平板凝集試驗（RBPT）和全乳環(huán)狀試驗（MRT）是3種常用的血清學(xué)試驗。SAT于1897年開始應(yīng)用，目前在發(fā)達國家已經(jīng)停用，但在我國仍然是使用廣泛的布病檢測方法[23]，該方法對IgM、IgG 敏感性較高，可用于布病的早期診斷，也可用于疫苗免疫抗體的檢測，對急性布病也有較好的檢測效果[20，26]。但該方法操作相對繁雜、耗時較長，不適用于現(xiàn)場快速檢測[21，27]。李翠等[28]將SAT 改進為微量試管凝集試驗（MSAT），具有稀釋方法簡便、省時省力、節(jié)約抗原血清等優(yōu)點。RBPT 是一種經(jīng)典的血清凝集試驗，其抗原是將滅活布魯氏菌菌體經(jīng)虎紅染料染色后懸浮于pH 為3.7 左右的乳酸緩沖液中制成。該方法敏感性較高、價格便宜、操作方便、檢測快速，但特異性和準確性一般，受試驗溫度和凝集時間影響，不易準確判定結(jié)果[20，24]，故常用于動物群體布病的普查和人布病的初篩及監(jiān)測，而不作為確診試驗[12-13]。MRT 主要通過檢測乳樣中的布魯氏菌抗體來篩查泌乳期牛群的布病，其本質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)，當奶樣中存在布魯氏菌抗體時，與染成紅色的布魯氏菌抗原形成抗原抗體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至乳脂層形成紫紅色乳脂環(huán)[5，22]。此方法操作簡便、成本較低，常用于奶牛布病的現(xiàn)場篩查，但其敏感性較差，如檢測牛群的大量乳樣或者奶樣中含有初乳時，可能導(dǎo)致假陽性反應(yīng)[27]。

3.2.2 補體結(jié)合試驗（CFT） CFT 相對于常規(guī)血清學(xué)檢測方法，具有敏感度高、特異性強的特點，是目前布病血清學(xué)診斷中最準確的方法之一[12，21]。此外，CFT 是國際貿(mào)易指定試驗，也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）公認的確診方法，廣泛應(yīng)用于牛、羊、人布病的診斷，由于豬自身補體能干擾豚鼠補體，因此不適用于豬布魯氏菌的檢測[29]。CFT 的缺點是對試驗條件要求較高、操作過程繁瑣、檢測結(jié)果受主觀因素影響較大，因此不適用于基層和現(xiàn)場檢測[5，30]。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ELISA 方法的特點是簡便快速、特異性強、所需樣品少且過程易標準化等，不僅可以用于大量樣本的篩查，也可作為確診試驗[31-32]。ELISA 是國際貿(mào)易指定試驗，于2004年被OIE 列為診斷牛種布病的推薦方法[31，33]。但是ELISA 成本較高、對試驗條件要求高，需在國家生物二級實驗室內(nèi)進行，不適用于基層和現(xiàn)場快速檢測[21，34]。

3.2.4 熒光偏振試驗（FPA） FPA 通過將熒光素標記的小分子抗原加到待檢血清或其他可能存在抗體的液體中，若存在相應(yīng)抗體，抗體與標記抗原結(jié)合后會降低轉(zhuǎn)速，通過儀器測量減速便可確定相應(yīng)抗體的存在[35]。FPA 方法屬于同源性分析，無需將分離物分離，因而簡便快捷，是國際貿(mào)易指定試驗。FPA 診斷布病的敏感性和特異性與cELISA 相近[36]，但檢測更快速，可在2 min（血清）或15 s（全血）內(nèi)測定抗體含量。FPA 在某些發(fā)達國家已經(jīng)大量應(yīng)用，成為檢測動物布病快速、高通量的新技術(shù)，主要用于動物群體布病的檢疫、篩查和凈化[37]。

3.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.3.1 PCR 檢測技術(shù) PCR 技術(shù)因其檢測特異性強、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)勢而在布病的檢測和種型鑒別等方面應(yīng)用日益廣泛[20，38]。目前主要的PCR 方法有常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR 等。20 世紀90年代常規(guī)PCR 開始用于布病的診斷，該方法靈敏度高、特異性強，檢測時間相對較短，可用于大量樣品的檢測[17，39]。常規(guī)PCR 可以作為人布病的常規(guī)檢測方法，適用于臨床癥狀明顯但血清學(xué)檢測為陰性的患者[40]。多重PCR 在同一反應(yīng)體系內(nèi)，加入2對或2 對以上的引物，可以同時檢測多種病原，除了具有靈敏度高、特異性強的特點外，還有準確性高、經(jīng)濟便捷等優(yōu)點[24]。實時熒光定量PCR是目前確定樣品DNA 拷貝數(shù)最敏感、最準確的方法之一，實現(xiàn)了DNA 或RNA 模板的精確定量，具有高度特異性、敏感性和可重復(fù)性。相比其他PCR 方法，實時熒光定量PCR 操作簡便、不需電泳步驟，縮短了檢測時間[5，41]。但由于實時熒光定量PCR 所需設(shè)備及試劑比較昂貴、對試驗人員技能要求較高，不適用于基層推廣[5]。

3.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP） LAMP診斷布病，是針對布魯氏菌的特異性基因序列設(shè)計引物，通過先擴增再分析的模式進行病原檢測[24]。但LAMP 技術(shù)不需要苛刻的試驗條件和專業(yè)的儀器設(shè)備，其結(jié)果判定通過肉眼可直接觀察，整個檢測過程可在1 h 內(nèi)完成，適合在布病的基層防控工作中使用[42]。

4 疫苗研究進展

布魯氏菌疫苗的研究最早開始于20 世紀，早期曾使用滅活疫苗用于人和動物的布病防控，后被免疫效果更好的弱毒疫苗取代[43]。至今，尚無國際認可的針對人類的布病疫苗，很多國家對人類使用疫苗免疫存在異議。目前對于動物布病的防控，主要使用的是弱毒活疫苗。此外，基因缺失疫苗、DNA 疫苗以及重組亞單位疫苗等新型疫苗處在研發(fā)試驗階段。

4.1 弱毒活疫苗

因活疫苗可以有效刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久良好的保護效果，因此目前大部分成功應(yīng)用的疫苗均為弱毒活疫苗。如牛種布魯氏菌S19 疫苗、粗糙型牛種布魯氏菌RB51 疫苗、羊種布魯氏菌Rev1 疫苗和豬種布魯氏菌S2 疫苗等。

4.1.1 牛種布魯氏菌S19 疫苗 S19 疫苗在我國稱為A19 疫苗，主要用于奶牛的布病預(yù)防[44]。S19 菌種最初是1923年從美國一牛場分離并通過實驗室培養(yǎng)而獲得[45]。目前國際上使用的S19 疫苗是由美國科學(xué)家篩選到的對赤蘚糖醇敏感的菌株，由于菌株ery基因缺失，使毒力進一步減弱、安全性更高[46-47]。S19 疫苗的生產(chǎn)和使用需要穿戴必要的防護裝備，但近年來仍有疫苗生產(chǎn)和接種過程中造成人員感染的事件發(fā)生[8，48]。因此，對S19 疫苗的研究方向主要是對其進行基因改造，既保留其免疫原性又能降低其毒力[49]。

4.1.2 粗糙型牛種布魯氏菌RB51 疫苗 RB51疫苗菌株是19 世紀80年代末由美國科學(xué)家研制的粗糙型突變株[43]。RB51 疫苗對牛的安全性比S19 疫苗高，但對懷孕母牛靜脈注射疫苗仍可引起25%的個體出現(xiàn)早產(chǎn)現(xiàn)象，且仍能造成人的感染[49]。此外，RB51 菌株具有利福平抗性[50]，而利福平卻是治療布病最有效的藥物之一[51]，因此RB51 疫苗的使用不利于布病的抗生素治療。

4.1.3 羊種布魯氏菌Rev.1 疫苗 Rev.1 疫苗菌株是美國科學(xué)家將羊種布魯氏菌6056 野毒株在鏈霉素抗性培養(yǎng)基上反復(fù)傳代獲得的光滑型變異株，主要用于綿羊及山羊的布病防控[51-52]。Rev.1疫苗相比S19 疫苗提供的免疫保護更強，抗體持續(xù)時間更長[53]，但其毒力也比較強[46]。研究表明，采用黏膜免疫方式接種Rev.1 疫苗可以到達與皮下接種相近的免疫效果[43]。但黏膜免疫方式的開放性，增加了操作人員感染風(fēng)險[54]。

4.1.4 豬種布魯氏菌S2 疫苗 S2 疫苗菌株是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所由進口母豬流產(chǎn)胎兒中分離的布魯氏菌，經(jīng)傳代培養(yǎng)獲得的光滑型弱毒株[43，55]。S2 疫苗毒力較S19 和Rev.1 疫苗弱，對羊、牛、豬均能產(chǎn)生良好的免疫保護，其最大的優(yōu)點是通過口服接種方式不會引起母畜流產(chǎn)[8，56]。S2 疫苗除口服免疫方式外，還可以通過肌肉注射、皮下注射和黏膜免疫等方式接種羊、牛、豬以及牦牛等動物，但注射方式不能用于牛、小尾寒羊和懷孕母畜[46]。

4.2 新型疫苗

隨著分子生物學(xué)及重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)新型疫苗成為近年來的研究熱點。

4.2.1 基因缺失疫苗 基因缺失疫苗的安全性高，因其遺傳背景清楚，可以通過病原學(xué)和血清學(xué)方法區(qū)分疫苗免疫和野毒感染[43]。目前鑒定出的布魯氏菌毒力基因已經(jīng)超過180個，這為基因缺失疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)[57]。研究結(jié)果表明，疫苗產(chǎn)生的保護力與其毒力正相關(guān)。因此在疫苗研發(fā)過程中，可以綜合考慮疫苗的安全性、毒力及保護力等因素，對分離野毒株、強毒株進行基因缺失或者對現(xiàn)有活疫苗進行優(yōu)化[46]。

4.2.2 DNA 疫苗 布魯氏菌屬于胞內(nèi)寄生菌，機體的細胞免疫是控制其感染的關(guān)鍵，因此布病DNA 疫苗的候選分子主要為能刺激T 細胞引起細胞免疫的分子[58]。DNA 疫苗缺點是免疫效果差且單獨使用不易誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[59]，其用于人和動物的具體效果還有待驗證，目前尚無DNA 疫苗能完全取代弱毒苗[47]。

4.2.3 重組亞單位疫苗 重組亞單位疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、抗原成分單一、常規(guī)血清學(xué)方法可以鑒別等優(yōu)點[17，58]。2010年Kazak等[60]利用L7/L12 制備的亞單位疫苗在臨床上誘導(dǎo)了Th1 型免疫應(yīng)答，但重組亞單位疫苗研發(fā)成本較高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、免疫效果不佳[4]。為增強免疫效果，可將幾個蛋白或多個有效的多肽進行重組，該方法可以提高其免疫原性、增強其免疫效果[61]。目前布魯氏菌重組亞單位疫苗用于動物免疫的試驗不多，研究尚處初級階段[46]。

5 討論

目前，全球范圍內(nèi)布病疫情呈反彈趨勢，隨著畜牧業(yè)的集約化發(fā)展，以及牛羊及其產(chǎn)品的跨區(qū)域頻繁調(diào)運，我國布病疫情雖然維持相對穩(wěn)定水平，但每年總體發(fā)病數(shù)量仍然較高。國內(nèi)外針對布病的診斷技術(shù)方法較多，目前主要采取多法并存、相互補充的方式，尚無能夠獨立確診布病的方法。此外，建立能夠區(qū)分疫苗免疫與自然感染的布病鑒別診斷技術(shù)對于布病的凈化及控制具有較為重要的意義。

布病的防控要堅持免疫預(yù)防為主的策略，但現(xiàn)有疫苗各有優(yōu)缺點，難以完全控制疫情發(fā)生，部分疫苗還會干擾后期實驗室診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在對布魯氏菌致病性及免疫原性深入研究的基礎(chǔ)上，期待能夠出現(xiàn)靈敏性高、特異性強、高效便捷且易推廣的診斷技術(shù)。同時加強各類新型疫苗研發(fā)，研制出安全性高、副作用低、免疫效果好的疫苗，為布病的控制和凈化服務(wù)。