曾貴榮，楊 柳，羅桂芳，姜德建

(湖南省藥物安全評價研究中心&新藥藥效與安全性評價湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410331)

近年來，隨著老齡化社會的加快，骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等與年齡相關(guān)的疾病發(fā)病率逐年攀升，給醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)帶來了巨大挑戰(zhàn)，目前以化學(xué)藥物和手術(shù)治療為支柱的傳統(tǒng)西醫(yī)治療逐漸遭遇瓶頸，而以干細(xì)胞技術(shù)為核心的再生醫(yī)學(xué)快速發(fā)展并走上臨床應(yīng)用，為人類衰老性疾病治療注入了新的希望和活力[1-7]。據(jù)ClinicalTrials.gov統(tǒng)計，全球210多項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞處于臨床研究[8]，主要集中于傷口愈合，骨骼肌、心血管、肝腎疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病以及器官移植等。然而間充質(zhì)干細(xì)胞的生物安全限制了其臨床的應(yīng)用，主要表現(xiàn)在人體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞較少，無法分離后直接輸入體內(nèi)用于細(xì)胞治療[9]，且臨床治療需要滿足以下條件[10]：充足的細(xì)胞量，分化成特定的細(xì)胞，輸注后受體中細(xì)胞存活且有效，移植后對受體安全。相應(yīng)地，細(xì)胞治療包括供體選擇、間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)擴(kuò)增、臨床前、臨床療效和安全性評價、移植等過程[11]，其中任何一個環(huán)節(jié)存在問題都將影響治療的安全和療效。作為一種新的治療形式，間充質(zhì)干細(xì)胞生物安全是細(xì)胞治療能否進(jìn)入臨床應(yīng)用，保障患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵問題。因此系統(tǒng)的綜述目前間充質(zhì)干細(xì)胞生物安全有助于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞治療的發(fā)展與應(yīng)用。本綜述從間充質(zhì)干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性、致癌性、免疫原性等方面闡述間充質(zhì)干細(xì)胞治療的生物安全研究進(jìn)展，為降低間充質(zhì)干細(xì)胞治療風(fēng)險提供參考。

1 干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞概述

干細(xì)胞是一種未完全分化的、具有自我增殖和高度分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)來源和分化增殖能力不同，將干細(xì)胞分成多能胚胎干細(xì)胞、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和多能成體干細(xì)胞等三大主要細(xì)胞類型[1]。干細(xì)胞具有非常強(qiáng)的分化能力，在特定條件下可被分化成神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞，移植進(jìn)入機(jī)體可替換損傷組織或產(chǎn)生修復(fù)因子促進(jìn)組織再生[2]，干細(xì)胞的分化能力極大地推動了再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和退行性疾病的治療，具有傳統(tǒng)化學(xué)藥物、生物藥物不具備的優(yōu)勢。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于中胚層具有自我復(fù)制更新和多向分化的多能干細(xì)胞，具有獨(dú)特的免疫表型和免疫調(diào)節(jié)能力，屬于多能成體干細(xì)胞。相對于多能胚胎干細(xì)胞、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，它的分化和增殖能力較弱[3]。自上世紀(jì)六七十年代，F(xiàn)riedenstein研究組首次發(fā)現(xiàn)一群位于動物骨髓細(xì)胞中的邊緣細(xì)胞群具有成骨能力，起初被定義為貼壁集落形成單元成纖維細(xì)胞[4]。因這群細(xì)胞可生成骨骼組織相關(guān)的細(xì)胞，被認(rèn)為是干細(xì)胞，也有稱為造血干細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞?；诩?xì)胞的功能演化成成骨干細(xì)胞或骨髓間質(zhì)細(xì)胞。此外，這一細(xì)胞在包括人類在內(nèi)的其他物種中得以證實(shí)。隨后，為適應(yīng)起源于胚胎中胚層細(xì)胞的概念，Caplan等[5]首次提出“成年間充質(zhì)干細(xì)胞”這一概念，并被科學(xué)家和臨床醫(yī)生廣泛應(yīng)用。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于多種人體組織，最主要的來源為骨髓和脂肪組織[1]。也可從臍帶血、胎盤、羊膜、牙髓、腦、子宮內(nèi)膜、皮膚、鼻粘膜等組織分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。它不僅可直接分化成組織特異性細(xì)胞修復(fù)傷口而且可通過釋放抗炎細(xì)胞因子、抗凋亡和生長因子的旁分泌的形式刺激組織修復(fù)，被認(rèn)為是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的強(qiáng)有力工具[6-7]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞可在炎癥、腫瘤和損傷部位歸巢替代或修復(fù)損傷的組織[1]?；谄洫?dú)特優(yōu)勢，間充質(zhì)干細(xì)胞是細(xì)胞治療的理想候選物，在組織再生、癌癥、骨關(guān)節(jié)病等方面具有廣闊的前景。

2 遺傳穩(wěn)定性及其影響因素

歐洲藥品監(jiān)督管理局出臺的《關(guān)于干細(xì)胞的醫(yī)療產(chǎn)品的反思報告》對細(xì)胞治療產(chǎn)品無污染、活力、生長曲線、細(xì)胞鑒定、純度、效力和遺傳穩(wěn)定性做了詳細(xì)的管理規(guī)定，特別強(qiáng)調(diào)遺傳穩(wěn)定性是主要的安全擔(dān)憂[12]。遺傳穩(wěn)定性指標(biāo)表現(xiàn)為染色體畸變、微核異常、DNA損傷、端?？s短、表觀遺傳失調(diào)等。遺傳不穩(wěn)定與癌變密切相關(guān)，染色體核型分析是評價細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的金標(biāo)準(zhǔn)[13]。干細(xì)胞擴(kuò)增可降低DNA聚合酶和DNA修復(fù)效能進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳突變、表觀遺傳學(xué)改變、DNA雙鏈斷裂[14-15]。而DNA損傷阻滯轉(zhuǎn)錄和復(fù)制驅(qū)動細(xì)胞衰老及轉(zhuǎn)分化失常，進(jìn)一步加劇組織老化和年齡相關(guān)的癌變[16-17]。

遺傳穩(wěn)定性受供體、組織來源、擴(kuò)增過程培養(yǎng)條件、儲存條件、傳代次數(shù)等影響[18]。Stultz等[19]對不同供體和代數(shù)的骨髓源性人間充質(zhì)干細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性分析顯示，相比于第5、7代，第3代異常核型更多，且隨著代數(shù)增加，異常核型逐漸降低。根據(jù)供體年齡不同分成老年組(39～41歲)和年輕組(22～31歲)，發(fā)現(xiàn)老年組供體主要為染色體易位，而年輕組為非整倍體，但老年組與年輕組的染色體并無顯著差異，提示間充質(zhì)干細(xì)胞染色體異常主要發(fā)生在早期代數(shù)，隨著傳代次數(shù)越多，染色體越趨于成熟穩(wěn)定。Duarte等[20]比較了低溫保存前后對人臍靜脈間充質(zhì)干細(xì)胞的染色體狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)液氮凍存后檢測到非克隆型染色體畸變，17個細(xì)胞中期中12個細(xì)胞顯示單體性(2個標(biāo)記染色體，其他為染色體斷裂)，5個細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。凍存2個月的細(xì)胞染色體3短臂臂內(nèi)發(fā)生倒位。Sharma等[21]評價了高糖、缺血、缺氧、饑餓等不同培養(yǎng)條件下人臍帶和胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)突然降低氧濃度可增加核泡數(shù)量，減少細(xì)胞增殖，但未誘導(dǎo)衰老；而在高糖、缺血以及低氧血清饑餓下間充質(zhì)干細(xì)胞遺傳保持穩(wěn)定。Vinogradov等[22]采用熱休克模擬高溫環(huán)境下人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分子遺傳特征，G帶顯示染色體隨機(jī)斷裂和非整倍體；染色體核型分析觀察到細(xì)胞無基因組不平衡現(xiàn)象；mRNA測序數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，熱休克誘導(dǎo)錯配，破壞DNA修復(fù)。人間充質(zhì)干細(xì)胞暴露在20% O2下培養(yǎng)顯著增加氧化應(yīng)激水平，誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂、染色體畸變、非整倍體以及端?？s短；而3% O2的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞的壽命延長，遺傳穩(wěn)定性顯著增加；利用原位雜交分析人脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的染色體8、11、17，發(fā)現(xiàn)低氧降低非整倍體發(fā)生率；表明低氧條件有助于增強(qiáng)人間充質(zhì)干細(xì)胞治療的安全性[23]。

綜上可知，間充質(zhì)干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性直接影響細(xì)胞的衰老、轉(zhuǎn)分化進(jìn)而可引起衰老和癌變，是干細(xì)胞治療中的主要安全問題。其遺傳穩(wěn)定性主要受到擴(kuò)增傳代次數(shù)、培養(yǎng)條件、保存環(huán)境的影響，深入研究影響間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性機(jī)制，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)條件并建立細(xì)胞產(chǎn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，有利于提高細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性，保障細(xì)胞治療安全。

3 致癌特性及其影響因素

致腫瘤發(fā)生是間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療最重要風(fēng)險之一。由于間充質(zhì)干細(xì)胞本身的自我更新和分化潛能，長期培養(yǎng)能自發(fā)性轉(zhuǎn)化成其他細(xì)胞，大多數(shù)可分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等無害細(xì)胞，也可能分化成惡性細(xì)胞[24-25]，這是間充質(zhì)干細(xì)胞的固有特性。前期研究顯示，癌癥細(xì)胞的起源和惡變與間充質(zhì)干細(xì)胞特征相似，如長期的增殖、生長調(diào)控機(jī)制[26]。事實(shí)上，在一項(xiàng)將大量未分化的人胚胎干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠觀察到畸胎瘤生長的研究報道后[27]，干細(xì)胞的致癌風(fēng)險被推向了風(fēng)口浪尖，給干細(xì)胞快速發(fā)展?jié)采狭艘慌枥渌?，警醒企業(yè)、臨床和科學(xué)界關(guān)注干細(xì)胞治療的生物安全問題。盡管迄今未見間充質(zhì)干細(xì)胞形成畸胎瘤的報道，但由于它具有自我增殖、分化等與干細(xì)胞相同的特性，其致癌發(fā)生風(fēng)險仍不能忽視。

干細(xì)胞的致腫瘤發(fā)生受到環(huán)境因素影響，如遺傳操作和體外培養(yǎng)。文獻(xiàn)報道，長時間培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞具有致瘤發(fā)生的潛能，轉(zhuǎn)化成為高核質(zhì)比、高端?；钚院透咴鲋的芰Φ纳掀蛹?xì)胞[28-29]。此外，遺傳不穩(wěn)定性與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[30]，如在高氧可誘導(dǎo)染色體畸變、DNA損傷。Conforti等研究[31]了電離輻射和饑餓應(yīng)激下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的惡變情況，發(fā)現(xiàn)輻射和饑餓的間充質(zhì)干細(xì)胞失去了典型的紡錘形形態(tài)、生長速率降低，但保持了正常的的免疫和分化功能，更為重要的是未表現(xiàn)出惡性癌變傾向。Yong等[32]評估了長期保存人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的致瘤發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)利用低溫細(xì)胞保護(hù)劑冷凍保存3個月細(xì)胞的腫瘤抑制因子p53、p21、p16、pRb、hTERT、端粒酶活性和端粒長度未見明顯變化，DNA損傷和p53突變無顯著影響，表明長期保存脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生腫瘤風(fēng)險較低。給小鼠注射脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞1年后顯示，移植細(xì)胞被完全清除，未見腫瘤發(fā)生[33]。然而，研究發(fā)現(xiàn)將間充質(zhì)干細(xì)胞移植到SCID小鼠中，觀察到腫瘤的生長現(xiàn)象[29]。椎管內(nèi)內(nèi)嗅粘液細(xì)胞自體移植8年后，一位年輕的脊髓損傷患者出現(xiàn)自體移植物來源的脊髓腫塊，腫塊組織學(xué)上與嗅黏膜相似[34]。2009年，文獻(xiàn)報道一例胎兒神經(jīng)干細(xì)胞移植治療共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張4年后發(fā)生膠質(zhì)神經(jīng)腦瘤，基因分析顯示腫瘤細(xì)胞來源于供體[35]。

綜上，間充質(zhì)干細(xì)胞自身固有特性和培養(yǎng)環(huán)境是致瘤性的決定因素。腫瘤發(fā)生與免疫缺陷相關(guān)，由于間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制的作用，故間充質(zhì)干細(xì)胞可能調(diào)控免疫促進(jìn)腫瘤發(fā)生。盡管現(xiàn)有研究提示間充質(zhì)干細(xì)胞移植的致瘤風(fēng)險較低，但在間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用前，仍需嚴(yán)格評估其致瘤發(fā)生潛在影響。

4 免疫原性及其影響因素

干細(xì)胞從健康志愿者分離獲得(同種異體)，也可從患者自身分選制備。在同種異體干細(xì)胞移植面臨倫理問題和免疫排異反應(yīng)[36]。人間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[37]，當(dāng)機(jī)體免疫過低時，間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)炎癥。相反，免疫過度激活時，間充質(zhì)干細(xì)胞抑制炎癥進(jìn)而避免自身攻擊。因此，有觀點(diǎn)認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫特權(quán)，移植時可能不會誘發(fā)免疫反應(yīng)[38]。

間充質(zhì)干細(xì)胞通過以下途徑發(fā)揮免疫調(diào)控作用：通過抑制分裂素、異種抗原的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，誘導(dǎo)初始T細(xì)胞無能，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增，抑制對同種異體細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞毒性從而抑制T淋巴細(xì)胞功能；它還可通過抑制自然殺傷細(xì)胞對病毒感染細(xì)胞的殺傷作用，抑制IL-2驅(qū)動NK細(xì)胞增殖和INF-γ釋放；此外，間充質(zhì)干細(xì)胞也可下調(diào)樹突細(xì)胞共刺激分子表達(dá)，抑制單核細(xì)胞和CD34+祖細(xì)胞分化成樹突細(xì)胞，降低促炎細(xì)胞因子IL-12、INF-γ、TNF-α的釋放而增加IL-10分泌。間充質(zhì)干細(xì)胞可作為抗原呈遞細(xì)胞將HLA-Ⅰ限制性病毒或腫瘤抗原加工呈遞給CD4+T細(xì)胞，釋放少量的INF-γ和顆粒酶B，但其T淋巴細(xì)胞殺傷毒性效果非常有限[39]。Klyushnenkova等[40]評估了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激活同種異體T細(xì)胞能力，發(fā)現(xiàn)異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無法促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞增殖，但可釋放INF-γ。將間充質(zhì)干細(xì)胞加入初始混合淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性，其發(fā)生與是否進(jìn)行INF-γ預(yù)處理無關(guān)，表明間充質(zhì)干細(xì)胞開始可激活異體T細(xì)胞，但由于其免疫抑制作用無法引起T細(xì)胞增殖反應(yīng)。以上均提示同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制作用且較低的免疫原性。

Deuse等[41]比較了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和成年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫原性，結(jié)果顯示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HLA-Ⅰ 表達(dá)更低，TGF-β和IL-10生成更多，增殖更快。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對異體淋巴細(xì)胞激活和體內(nèi)免疫活化能力更強(qiáng)，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫識別能力更弱。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在完全免疫小鼠顯示更快的排異反應(yīng)。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞移植后產(chǎn)生了抗體和顯著的免疫排異反應(yīng)[42]。體外研究顯示，大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞對異體T細(xì)胞無法激活，而INF-γ和IL-1β處理后，間充質(zhì)干細(xì)胞上調(diào)MHCⅠ、Ⅱ和血管粘附分子-1，增加T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)。接受間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植的大鼠的免疫活化標(biāo)志物CD25、CD71顯著上調(diào)，生成同種抗體促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解作用[43]。Huang等[44]研究了間充質(zhì)干細(xì)胞分化對細(xì)胞免疫的影響，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成的肌原性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞組織相容性復(fù)合體Ⅰa、Ⅱ 表達(dá)增加，Ⅰb則降低。這些細(xì)胞與異體白血球共培養(yǎng)后細(xì)胞毒性顯著增加。采用分化的細(xì)胞處理心肌梗死大鼠，檢測心肌功能6個月，發(fā)現(xiàn)移植3個月后，間充質(zhì)干細(xì)胞顯著改善心室功能。而異體分化的細(xì)胞在移植后5周被完全清除，移植5個月后其療效喪失，表明間充質(zhì)干細(xì)胞分化后免疫激活排斥功能增加。Liu等[45]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞與異體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)顯示淋巴增殖反應(yīng)，接受成骨細(xì)胞移植的新西蘭白兔表現(xiàn)出明顯的皮膚排異反應(yīng)，該研究同樣證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞分化成特定細(xì)胞可產(chǎn)生顯著的免疫排斥反應(yīng)。

綜上，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制作用，但不具有免疫特權(quán)。間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植需注意免疫排異反應(yīng)，且其免疫排斥反應(yīng)與其組織來源、分化狀態(tài)密切相關(guān)。

5 結(jié)語

間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我增殖、分化潛能、免疫調(diào)控功能，是細(xì)胞治療的理想材料，在發(fā)育和再生醫(yī)學(xué)中表現(xiàn)光明的前景。在間充質(zhì)干細(xì)胞治療的發(fā)展過程中，其生物安全(遺傳不穩(wěn)定、致腫瘤發(fā)生、免疫排異反應(yīng)等)會直接影響其臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，已成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙。為了推動干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，國內(nèi)外相關(guān)部門做出了許多努力，但目前對間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及其生物安全的研究國內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和體系，國家知識產(chǎn)權(quán)局甚至將干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)、免疫治療等明確列為急需知識產(chǎn)權(quán)支持和國家重點(diǎn)發(fā)展的產(chǎn)業(yè)之一。在間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用前，需根據(jù)《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、《中華人民共和國藥典》、ISCT-間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)(2006)，對生物安全風(fēng)險因素，如微生物、內(nèi)毒素、致瘤性、異常毒性、殘留性、核型異常率進(jìn)行檢測，且國際細(xì)胞治療協(xié)會也制定了間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的放行標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)以上原則來降低干細(xì)胞應(yīng)用的生物安全風(fēng)險。未來需要深入研究間充質(zhì)干細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定、致癌、免疫排異的發(fā)生機(jī)制，對間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品制備和臨床治療進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，建立質(zhì)量控制和安全評估標(biāo)準(zhǔn)體系，和準(zhǔn)則，消除存在的安全隱患，保障人類安全。