王樂旬，吳惠娟，張盛昔，榮向路，郭姣

(廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心/廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/粵港澳聯(lián)合代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的全球患病率逐年上升，已成為威脅人類健康的主要疾病之一，主要分為1型(T1DM)和2型(T2DM)。T1DM作為目前高發(fā)的一種慢性胰島素依賴性自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)胰腺，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞破壞，進(jìn)而使其喪失合成和分泌胰島素的功能[1]。然而，臨床上對(duì)T1DM的防治措施尚不完善，還需要對(duì)其進(jìn)行深入的研究。因此，建立較理想的動(dòng)物模型對(duì)研究該病的發(fā)病機(jī)制和治療具有重要意義。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一種從鏈霉菌中提取的抗生素，因其具有毒性低、用藥量小、高特異性的破壞胰島β細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，為目前世界范圍內(nèi)最常用的誘發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)糖尿病的化學(xué)誘導(dǎo)劑[2]。STZ誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生及類型與鼠的種系、性別、用藥劑量和次數(shù)有關(guān)[2]。經(jīng)典的誘導(dǎo)T1DM方法是多次小劑量STZ注射，但用藥劑量、是否饑餓、模型成功率以及小鼠死亡情況文獻(xiàn)報(bào)道不一[3-5]。本研究采用多次腹腔注射STZ或先饑餓然后給予腹腔注射STZ誘導(dǎo)C57BL/6小鼠T1DM，以篩選模型成功率較高、小鼠死亡率較低的造模方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10周的雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。小鼠飼養(yǎng)在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2017-0125，室內(nèi)溫度25 ℃，相對(duì)濕度70%～90%，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水和攝食。

1.2 試劑與儀器

分析純的檸檬酸和檸檬酸鈉購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠;STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羊血清和DAB顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；胰島素一抗為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；ONETOUCH ultraeasy血糖儀及試紙購(gòu)自美國(guó)Johnson & Johnson公司；BX51WI顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；Vectra顯微鏡分析軟件為美國(guó)PE公司產(chǎn)品。

1.3 溶液的配制

檸檬酸鹽緩沖液：稱取檸檬酸2.1 g加雙蒸水100 mL配成A液，檸檬酸鈉2.94 g加雙蒸水100 mL配成B液，將A、B液按1∶1(V∶V)混合，嚴(yán)格調(diào)節(jié)pH在4.2～4.5，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。

STZ溶液：稱取STZ裝于一干燥的滅菌管中，外用錫紙包好，用預(yù)冷的檸檬酸鹽緩沖液溶解，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，30 min內(nèi)用完。

1.4 分組與建模

小鼠隨機(jī)分對(duì)照組(7只)、實(shí)驗(yàn)組一(經(jīng)典造模方法，12只)、實(shí)驗(yàn)組二(12只)以及實(shí)驗(yàn)組三(常用造模方法，11只)。實(shí)驗(yàn)組一[4-7]：未禁食，腹腔注射劑量為50 mg/kg的STZ，連續(xù)5 d；實(shí)驗(yàn)組二：不禁食，腹腔注射劑量為50 mg/kg的STZ，連續(xù)4 d，最后1天注射STZ的劑量加倍，為100 mg/kg；實(shí)驗(yàn)組三[3,8]：每天先禁食12 h，然后腹腔注射50 mg/kg的STZ，連續(xù)5 d。對(duì)照組注射與實(shí)驗(yàn)組等體積(5 mL/kg)的檸檬酸鹽緩沖液。

1.5 模型觀察指標(biāo)

注射STZ后每天觀察并記錄小鼠的一般狀況和死亡情況，一般狀況主要包括精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、運(yùn)動(dòng)情況和墊料有無尿濕等，并及時(shí)更換尿濕的墊料；每天測(cè)量各組小鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量；最后1次注射后每周測(cè)量1次隨機(jī)血糖，連續(xù)4周，隨機(jī)血糖值≥15 mmol/L為建模成功[8-9]。比較各組的成模率和死亡率、成模小鼠的血糖值變化和體質(zhì)量變化等。

1.6 免疫組織化學(xué)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫臼處死小鼠，取胰腺組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片。對(duì)胰腺石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟和脫水后，利用枸櫞酸緩沖液加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；正常羊血清工作液封閉，胰島素一抗?jié)窈蟹跤^夜；PBS洗滌3次，每次5 min后，孵育生物素標(biāo)記二抗；PBS洗滌3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥和封片；然后顯微鏡觀察并拍照，并利用顯微鏡自帶分析軟件分析胰島面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況

對(duì)各組小鼠日?；顒?dòng)狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠毛發(fā)干凈、順、有光澤，精神狀態(tài)良好，比較活潑，反應(yīng)靈敏。各實(shí)驗(yàn)組均有不同程度地表現(xiàn)為活動(dòng)少、精神萎靡、毛發(fā)欠光澤、易脫毛、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，這些情況又以實(shí)驗(yàn)組二的表現(xiàn)最為明顯。

注射STZ第3天起飲水量和進(jìn)食量開始增加。選擇第4周對(duì)每天攝食和飲水情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組的攝食量顯著高于對(duì)照組(實(shí)驗(yàn)組一和三：P<0.05；實(shí)驗(yàn)組二：P<0.01)，所有實(shí)驗(yàn)組的飲水量均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。從飲水量上看，實(shí)驗(yàn)組二的飲水量是最高的，遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組一和實(shí)驗(yàn)組三(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組從STZ注射后第3天起出現(xiàn)多尿現(xiàn)象，3個(gè)模型組的墊料明顯比對(duì)照組墊料的濕度大。結(jié)果顯示多飲多食癥狀明顯。

2.2 不同建模方法對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

對(duì)照組的各小鼠體質(zhì)量逐步增長(zhǎng)；在STZ注射后第1周，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組二的小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比從第2周開始有了顯著差異(P<0.05)，這種差異一直維持到第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.01)；而實(shí)驗(yàn)組一的小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比，在第3周才出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，并且一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組三的體質(zhì)量差異變化不大，見表1。從第2周開始，實(shí)驗(yàn)組一和二的體質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組三的體質(zhì)量下降趨勢(shì)不明顯。

ABCDABCD5.04.03.02.01.00.0攝食量/g飲水量/mL15.010.05.00.0******##**##**

A.對(duì)照組； B.實(shí)驗(yàn)組一； C.實(shí)驗(yàn)組二； D.實(shí)驗(yàn)組三。與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與實(shí)驗(yàn)組二比較：##P<0.01。

圖1各組小鼠的攝食及飲水量

2.3 不同建模方法對(duì)小鼠隨機(jī)血糖的變化

通過不同時(shí)間測(cè)得的隨機(jī)血糖結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組一和二的隨機(jī)血糖在注射STZ后的第1周就顯著高于對(duì)照組的血糖(P<0.05)，這種升高一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(實(shí)驗(yàn)組一：P<0.05；實(shí)驗(yàn)組二：P<0.01)。而實(shí)驗(yàn)組三的血糖從第2周開始明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，第3周有升高趨勢(shì)，這種趨勢(shì)持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)。另外，不同實(shí)驗(yàn)組間的血糖也有差異。實(shí)驗(yàn)組三的血糖從第2周開始顯著低于實(shí)驗(yàn)組二的血糖(P<0.05)，且這種趨勢(shì)一直存在。見表2。

表1 各組小鼠建模后體質(zhì)量

組別n1周2周3周4周對(duì)照組723.89±1.8124.97±1.8525.56±2.0125.81±2.20實(shí)驗(yàn)組一1223.13±1.3723.63±1.4722.60±2.39?22.93±1.93?實(shí)驗(yàn)組二1222.78±1.3523.03±1.44?22.15±1.68??22.28±1.92??實(shí)驗(yàn)組三1122.52±1.5523.85±1.0623.26±1.3323.54±1.39

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.4 不同方法的建模成功率

根據(jù)隨機(jī)血糖值超過15 mmol/L即確定為1型糖尿病，分析了每次測(cè)量的血糖結(jié)果，如表3所示。在這3種不同方式建模中，實(shí)驗(yàn)組二在第1周的時(shí)候成功率最高，為41.7%，且于第2周有11只小鼠的血糖超過15 mmol/L(成功率為91.7%)，數(shù)量和血糖值均一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其次，實(shí)驗(yàn)組一小鼠的成模率在第3周才達(dá)到83.3%，第4周也并未增加。而實(shí)驗(yàn)組三的小鼠在第1和第2周時(shí)的成模率為36.4%，第3周和第4周分別比前2周增加了2只和3只小鼠，于第4周時(shí)成模率達(dá)到63.6%，在3種建模方式中成模率最低。

另外，在整個(gè)建模過程中，實(shí)驗(yàn)組二在第3周死亡1只小鼠，其余兩組均未發(fā)生小鼠死亡的情況。

表2 各組小鼠建模后隨機(jī)血糖值

c/(mmol·L-1)

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與實(shí)驗(yàn)組二比較：#P<0.05。

表3 各組小鼠成模率

Table3Modeling rate of mice in each group

%

2.5 模型鼠的胰腺改變

結(jié)果如圖2所示，和對(duì)照組相比，模型組小鼠的胰島普遍縮小(實(shí)驗(yàn)組一和二，P<0.01；實(shí)驗(yàn)組三，P<0.05)；形態(tài)上胰島細(xì)胞顯著減少且排列不規(guī)則。

A.對(duì)照組； B.實(shí)驗(yàn)組一； C.實(shí)驗(yàn)組二； D.實(shí)驗(yàn)組三。與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖2各組小鼠胰腺免疫組化

Figure2Immunohistochemistry of pancreas in mice of each group (200×,n=7)

3 討論

近年來隨著我國(guó)居民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，青少年的發(fā)病率也逐年升高。T1DM作為青少年常見疾病類型，可引起酮癥酸中毒、昏迷和糖尿病腎病等并發(fā)癥，對(duì)人類健康造成巨大影響。因此，對(duì)糖尿病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防與治療等研究成為熱點(diǎn)。為了克服現(xiàn)有模型的不足，構(gòu)建簡(jiǎn)單易操作、重復(fù)性好的糖尿病動(dòng)物模型顯得尤為重要。

目前常用糖尿病模型主要有藥物誘導(dǎo)模型、胰腺切除模型以及自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型等[7]，STZ是最為常用的藥物誘導(dǎo)劑。因STZ對(duì)胰島β細(xì)胞具有高度特異的選擇殺傷作用，故用STZ造模的成模率高，操作簡(jiǎn)便，且小劑量多次注射給藥可引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的β細(xì)胞損傷，出現(xiàn)自身免疫系統(tǒng)紊亂[2]。這種損傷與人類T1DM發(fā)病機(jī)制相似，因此受到格外關(guān)注。STZ誘導(dǎo)糖尿病注射方法有多種，腹腔注射較尾靜脈注射操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確快速，因此在本研究中，采取腹腔給藥途徑構(gòu)建糖尿病模型。對(duì)于給藥劑量，國(guó)內(nèi)外的研究多采用30～60 mg/kg[3,10-12]。本研究中選擇了50 mg/kg作為基礎(chǔ)劑量進(jìn)行注射，然后通過腹腔連續(xù)注射5 d，成功構(gòu)建1型糖尿病模型。

對(duì)于血糖的檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)，研究報(bào)道也不一致。有研究檢測(cè)空腹血糖，血糖值定為大于16.65 mmol/L[13]、15 mmol/L[8]或11.1 mmol/L[5,14]認(rèn)為糖尿病模型構(gòu)建成功。也有研究檢測(cè)隨機(jī)血糖，血糖值大于16.7 mmol/L[3,15]、15 mmol/L[9]、13.9 mmol/L[10]或11 mmol/L[16]作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇了操作較為簡(jiǎn)單的隨機(jī)血糖檢測(cè)，并且將模型構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)定為血糖值大于15 mmol/L。隨機(jī)血糖檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、方便易行，不用對(duì)動(dòng)物進(jìn)行饑餓處理，減少對(duì)動(dòng)物不必要的干預(yù)，符合動(dòng)物的倫理要求。

對(duì)于血糖的檢測(cè)時(shí)間，各報(bào)道并不一致。有些研究顯示，在最后一次STZ注射后的3 d檢測(cè)血糖高于標(biāo)準(zhǔn)之后就判定為模型構(gòu)建成功[3,9,17-18]；有些研究顯示，在末次注射后的1周檢測(cè)血糖值高于判定標(biāo)準(zhǔn)后認(rèn)為模型構(gòu)建成功[12-13,15]。考慮到STZ注射后3 d時(shí)間過短，胰島β細(xì)胞的損傷需要一定的時(shí)間，正如一些研究中顯示3 d時(shí)檢測(cè)的血糖低于1周時(shí)的血糖[13]，所以本研究選擇從注射后1周開始測(cè)量血糖，將血糖值大于15 mmol/L定為模型構(gòu)建成功。

有研究[8]顯示，注射STZ前禁食與否對(duì)模型的成功構(gòu)建有很大影響。如禁食可以增加建模的成功率。10～20 h建模成功率最高，禁食時(shí)間過短或過長(zhǎng)，建模成功率均下降[3,12]。但另外一些研究表明，在注射STZ前不禁食也可達(dá)到較高的建模成功率[9-10,15]。本研究比較了禁食12 h與不禁食對(duì)造模成功率的影響。通過4周的觀察和檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)禁食組的成模率(63.6%)低于未禁食組的成模率(83.3%)。造成這種現(xiàn)象的原因可能是禁食導(dǎo)致血糖和胰島素的分泌下降，進(jìn)而引起胰腺β細(xì)胞對(duì)葡萄糖類似物STZ的攝入下降所致[2,12]。

另外，本研究也對(duì)比了未禁食時(shí)5 d連續(xù)基礎(chǔ)劑量(50 mg/kg)注射和4 d基礎(chǔ)劑量+1 d加大劑量(100 mg/kg)建模情況，發(fā)現(xiàn)最后1天STZ的劑量加倍后能夠顯著提升糖尿病模型的建模成功率(100%)。胰腺的免疫組化結(jié)果也提示，末次加大劑量后能夠在前期損傷的基礎(chǔ)進(jìn)一步殺傷β細(xì)胞[2]。末次劑量加倍處理使血糖升高更快，水平也更高，和另外兩組相比，血糖幅度變化小。小鼠的大體形態(tài)、飲食和飲水、血糖水平等更符合糖尿病的模型標(biāo)準(zhǔn)。在模型鼠的死亡方面，除了實(shí)驗(yàn)組二有1只死亡外，其余兩組沒有小鼠死亡。

綜上，綜合成模率和死亡率，腹腔注射STZ 4 d基礎(chǔ)劑量(50 mg/kg)+1 d劑量加倍(100 mg/kg)，無需禁食，建成的糖尿病模型較為穩(wěn)定，成模率及成活率均較高，可作為1型糖尿病首選的建模方式。