馮紹貴，李彥宸，董春怡，文學(xué)方，余 平，3，曾哲靈

(1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌 330031； 2.南昌大學(xué)江西省藥食同源植物資源高值化利用重點實驗室，南昌 330031； 3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330047)

樟樹(Cinnamomumcamphora(L.) Presl)，又名香樟、烏樟、芳樟、樟木等，常綠高大喬木植物，屬樟科樟屬。我國樟樹資源豐富，主要分布于長江流域及長江以南地區(qū)。樟樹既是良好的綠化樹種，也是價值很高的經(jīng)濟樹種。樟樹的根、莖、葉、籽皮和肉中精油含量較高，已經(jīng)成為提取樟樹精油的主要原料。樟樹籽含樟樹籽仁油40%以上，樟樹籽仁油含中碳鏈脂肪酸95%以上，主要以癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)為主，屬于天然中碳鏈油脂。樟樹籽仁油具有快速補充能量、顯著減少體內(nèi)脂肪積蓄、降低血脂血糖水平及提高胰島素敏感性等改善體內(nèi)糖脂代謝紊亂作用[1-7]。

有關(guān)樟樹籽仁油甘油三酯結(jié)構(gòu)研究的文獻報道，至今都是依據(jù)當量碳原子數(shù)和脂肪酸組成來測定分析。本文采用高效液相色譜儀、三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，以三脂肪酸甘油酯為標樣，精確測定分析樟樹籽仁油的甘油三酯結(jié)構(gòu)，同時測定分析樟樹籽仁油的理化性質(zhì)及融化結(jié)晶特性，為樟樹籽仁油的后續(xù)研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樟樹籽，于2018年在江西省南昌市南昌大學(xué)校園內(nèi)采集10個不同地點的成熟樟樹籽。

乙腈、異丙醇，色譜純，TEDIA公司；三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三月桂酸甘油酯，美國Sigma公司；鹽酸、氯化鈉、無水乙醚、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉，分析純；三氟化硼甲醇溶液，德國CNW科技有限公司。

Agilent 6430三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配自動進樣系統(tǒng)、自動脫氣系統(tǒng)和DAD檢測器；Agilent 1260高效液相色譜儀，配蒸發(fā)光散射檢測器和C.01.03 安捷倫化學(xué)工作站；Agilent 7890B 氣相色譜儀；DH-50立式榨油機，樂齡市道行實業(yè)有限公司；BS223S型電子分析天平，德國賽多利斯有限公司；電熱恒溫水浴鍋；DHG-9101-2SA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 精煉樟樹籽仁油的制備

將樟樹籽去除果皮和果肉，在(40±1)℃烘至恒重，采用脫殼機脫殼得到樟樹籽仁，在120～130℃下采用榨油機壓榨得到樟樹籽仁毛油。測定毛油酸價，然后將毛油加熱至(60±1)℃，采用0.05 mol/L NaOH溶液堿煉脫酸，水洗除去皂腳，得到樟樹籽仁脫酸油，再將油加熱至(90±1)℃，加入油質(zhì)量2%～3%的活性白土，攪拌脫色20 min，趁熱真空過濾(真空度0.07～0.08 MPa)，得到精煉樟樹籽仁油。

1.2.2 樟樹籽仁油脂肪酸組成的測定

樟樹籽仁油脂肪酸甲酯化采用GB 5009.168—2016并改進方法[8]。稱取30 mg油樣于15 mL容量瓶中，加入3 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液，放入65℃的水浴中保持35 min，之后取出自然冷卻，加入3 mL 0.5 mol/L三氟化硼甲醇溶液，隨即放入70℃水浴中保持5 min，取出并自然冷卻，加入3 mL正己烷，振蕩1 min,最后加入6 mL飽和氯化鈉溶液，取上層有機相，加入無水硫酸鈉除水，用1 mL注射器吸取后過0.22 μm有機濾膜，待氣相色譜分析。

sn-2位和sn-1,3位脂肪酸組成分析采用胰脂肪酶酶解法[9]。準確稱量10 mg油樣，加入10 mL 1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8)、2 mL 0.05%膽酸鈉溶液、1 mL 2%氯化鈣溶液以及15 mg胰脂肪酶，混合振蕩均勻后于37℃水浴中反應(yīng)7 min，之后加入5 mL無水乙醚混合均勻，靜置分層后吸取乙醚層過無水硫酸鈉柱，濾液用氮氣吹干，用毛細管點于硅膠板上進行薄層色譜分析，展開劑為正己烷-無水乙醚-乙酸(體積比70∶30∶1)。干燥后用0.2% 2,7-二氯熒光黃甲醇溶液噴涂并置于紫外燈下觀察，刮下2-單甘酯條帶和其他條帶，分別置于離心管中并加入4 mL無水乙醚溶解，過無水硫酸鈉柱并用氮氣吹干濃縮，然后再進行甲酯化，待氣相色譜分析。

氣相色譜條件[10]：色譜柱為DB-23熔融石英毛細管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)；氫火焰離子化檢測器(FID)；載氣為氮氣，燃燒氣為氫氣和空氣；進樣口溫度250℃，壓力34 439.3 Pa；檢測器溫度280℃；進樣量1 μL；不分流進樣；氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，氮氣流速30 mL/min；升溫程序為初始柱溫50℃保持1 min，25℃/min升溫至175℃，3℃/min升溫至230℃保持10 min。

1.2.3 樟樹籽仁油甘油三酯結(jié)構(gòu)的定性和定量分析[11-12]

HPLC-ELSD樣品制備：稱取5 mg樟樹籽仁油樣品于5 mL離心管中，用異丙醇稀釋至5 mg/mL，旋渦振蕩溶解，過0.22 μm有機濾膜，進HPLC-ELSD分析。

HPLC-MS/MS樣品制備：稱取50 mg樟樹籽仁油樣品于15 mL離心管中，加入10 mL異丙醇，旋渦振蕩溶解，過0.22 μm有機濾膜后，稀釋1 000倍進HPLC-MS/MS分析。

HPLC-ELSD條件： Elite C18色譜柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為異丙醇；柱溫30℃；進樣量5 μL；采用梯度洗脫，0 min為70%A、30%B，30 min內(nèi)以0.8 mL/min變?yōu)?0%A、50%B；霧化室溫度45℃，氮氣流速1.6 L/min；增益1。

HPLC-MS/MS條件：HPLC條件同上，MS條件為APCI離子源，正離子模式，干燥氣溫度300℃，干燥氣流量5 L/min，霧化器壓力2.07×105Pa，鞘氣溫度350℃，鞘氣流量11 L/min，毛細管電壓4.2 kV，碎裂電壓150 V，碰撞能量25 V，質(zhì)量掃描范圍(m/z)100～1 000。

1.2.4 樟樹籽仁油理化性質(zhì)的測定

酸價的測定依照GB 5009.229—2016，皂化值的測定依照GB/T 5534—2008，碘值的測定依照GB/T 5532—2008，過氧化值的測定依照GB 5009.227—2016。

1.2.5 樟樹籽仁油融化和結(jié)晶特性測定

通過配備冷藏冷卻系統(tǒng)的差示掃描量熱儀(DSC8000，PE Instruments)測定樟樹籽仁油的熔融和結(jié)晶曲線。將樣品在鋁盤中稱重，范圍為5～10 mg。將樣品以50℃/min從17℃加熱至50℃，并在50℃保持10 min，然后以5℃/min降至-50℃，保持5 min，最后以5℃/min加熱至50℃[13]。使用Pyris軟件(Perkin-Elmer Instruments)分析溫度記錄圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016統(tǒng)計整理，采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析，用OriginPro 2017進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 樟樹籽仁油的脂肪酸組成(見表1)

從表1可以看出：樟樹籽仁油脂肪酸主要由中碳鏈脂肪酸組成，含量達96.58%，其中癸酸含量為(60.25±0.85)%、月桂酸含量為(35.88±0.63)%、辛酸含量為(0.45±0.02)%；長碳鏈脂肪酸主要是肉豆蔻酸、油酸、亞油酸，含量約為3%；sn-2位和sn-1,3位的脂肪酸組成有一些差異但相差不大。這表明樟樹籽仁油屬于天然的癸酸月桂酸型中碳鏈油脂，這與大豆油、玉米油、花生油、菜籽油等大宗長碳鏈油脂的脂肪酸組成不同。油脂的脂肪酸組成、脂肪酸在甘油分子上的位置、脂肪酸碳鏈長短和雙鍵個數(shù)影響油脂的理化性質(zhì)、體內(nèi)吸收代謝途徑和機制、生理作用[1]。中碳鏈脂肪酸的吸收代謝途徑與長碳鏈脂肪酸明顯不同，其消化吸收速率是長碳鏈脂肪酸的4倍，代謝速率則是長碳鏈脂肪酸的10倍。因此，長碳鏈油脂會因其脂肪酸在血液中吸收和代謝速率較慢容易造成過量堆積，進而引起肥胖、高血脂等脂代謝紊亂類疾病[14]，中碳鏈油脂不會引起肥胖等脂代謝紊亂問題[1]。因此，樟樹籽仁油是研發(fā)生產(chǎn)減肥降脂、快速供能類功能性油脂、營養(yǎng)補劑和特殊醫(yī)療用途食品的理想原料，具有很高的開發(fā)利用價值。

表1 樟樹籽仁油的脂肪酸組成 %

2.2 樟樹籽仁油的甘油三酯組成

樟樹籽仁油的HPLC-MS/MS總離子流圖見圖1，其對應(yīng)的甘油三酯質(zhì)譜棒狀圖見圖2。

圖1 樟樹籽仁油的HPLC-MS/MS總離子流圖

圖2 樟樹籽仁油HPLC-MS/MS總離子流圖中3個峰的質(zhì)譜棒狀圖

從圖1可以看出，樟樹籽仁油經(jīng)過色譜分離后得到3個色譜峰，色譜峰的分離度較好，達到基線分離。

用大氣壓化學(xué)電離(APCI)源分析甘油三酯可以得到[M]+、[M+H-RCOOH]+、[M+H-RCOO-R′CO]+和[RCO]+離子，根據(jù)[DAG]+離子和豐度可以判斷TAG結(jié)構(gòu)或脂肪酸與甘油結(jié)合的位置[15]。sn-2位上的脂肪酸一般不容易掉落形成碎片離子[16]。碳原子當量(ECN)(也稱等價碳數(shù)或當量碳數(shù))的計算方法為甘油三酯中脂肪酸的總碳原子數(shù)減去2倍的雙鍵數(shù)。使用反相高效液相色譜柱洗脫分離甘油三酯時，甘油三酯的保留時間與甘油三酯的 ECN、雙鍵數(shù)成線性關(guān)系[17]。甘油三酯中雙鍵增加會縮短其保留時間，每增1個雙鍵就會減少約2個碳原子的保留時間[18]。 利用甘油三酯準分子離子和失去1個脂肪酸結(jié)構(gòu)的碎片離子，結(jié)合3個甘油三酯標準品進行分析，鑒定出樟樹籽仁油的甘油三酯組成，結(jié)果見表2。

表2 樟樹籽仁油的甘油三酯組成

注：CCC.三癸酸甘油酯；CCLa.二癸酸月桂酸甘油酯；CLaLa.二月桂酸癸酸甘油酯；MCC.二癸酸肉豆蔻酸甘油酯。

由表2可知，對于Ⅰ號峰，在APCI正離子模式下，掃描模式為全掃，監(jiān)測得到準分子離子m/z572.4[M1+NH4]+和1個失去脂肪酸的碎片離子m/z383.3[M1+1-癸酸]+即[CC]+，綜合分析圖2(a)、色譜峰保留時間及ECN，確定Ⅰ號峰為CCC。對于Ⅱ號峰，監(jiān)測得到準分子離子m/z600.5[M2+NH4]+和2個失去1個脂肪酸的碎片離子m/z383.3[M2+1-癸酸]+即[CC]+、m/z411.3[M2+1-月桂酸]+即[CLa]+，綜合分析圖2(b)、甘油三酯裂解規(guī)律以及ECN，確定Ⅱ號峰為CCLa。對于Ⅲ號峰，監(jiān)測得到準分子離子m/z628.5[M3+NH4]+和3個失去1個脂肪酸的碎片離子m/z383.3[M2+1-癸酸]+即[CC]+、m/z411.3[M3+1-月桂酸]+即[CLa]+或[M3+1-癸酸]+即[MC]+、m/z439.3[M3+1-癸酸]+即[LaLa]+，綜合分析圖2(c)、裂解規(guī)律、相對分子質(zhì)量以及ECN，確定Ⅲ號峰為MCC和CLaLa的混合物。

2.3 樟樹籽仁油中不同甘油三酯的含量

樟樹籽仁油中甘油三酯的HPLC-ELSD色譜圖如圖3所示，采用面積歸一化法計算各色譜峰面積對應(yīng)甘油三酯的含量。結(jié)果表明，樟樹籽仁油中CCLa含量為56.38%，CLaLa和MCC含量為20.36%，CCC含量為12.55%。

圖3 樟樹籽仁油中甘油三酯的HPLC-ELSD色譜圖

2.4 樟樹籽仁油的理化性質(zhì)(見表3)

表3 樟樹籽仁油的理化性質(zhì)

由表3可知：樟樹籽仁油的酸價(KOH)為0.32 mg/g,說明精煉樟樹籽仁油中游離脂肪酸含量非常少；碘值(I)為5.70 g/100 g,表明樟樹籽仁油中飽和脂肪酸含量較高，這符合脂肪酸組成測定結(jié)果；皂化值(KOH)為267.30 mg/g，表明樟樹籽仁油中脂肪酸相對分子質(zhì)量較小，亦符合脂肪酸組成和甘油三酯結(jié)構(gòu)測定結(jié)果；過氧化值為0.03 g/100 g，表明樟樹籽仁油不易被氧化。精煉樟樹籽仁油的理化性質(zhì)達到國家食用植物油標準(GB 2716—2018)。

2.5 樟樹籽仁油的融化和結(jié)晶特性

甘油三酯的融化和結(jié)晶行為受其脂肪酸組成和分布的影響，甘油三酯含有的脂肪酸種類越多，甘油三酯的DSC曲線上出現(xiàn)的熔融和結(jié)晶峰越多。樟樹籽仁油的融化和結(jié)晶曲線見圖4。

圖4 樟樹籽仁油的DSC特性圖

從圖4可以看出：樟樹籽仁油在-4.27～5.16℃范圍內(nèi)出現(xiàn)結(jié)晶峰Ⅰ，且結(jié)晶溫度為1.54℃；樟樹籽仁油在15.34～22.56℃范圍內(nèi)出現(xiàn)吸熱峰Ⅱ，熔融溫度為21.63℃。樟樹籽仁油的熔融溫度為21.63℃，比人體體溫低15℃以上，樟樹籽仁油在室溫下可保持液態(tài)，可開發(fā)為功能食用油脂及營養(yǎng)補劑等產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

樟樹籽仁油中碳鏈脂肪酸含量高達95%以上，屬天然中碳鏈油脂。樟樹籽仁油中的甘油三酯結(jié)構(gòu)較簡單，主要含CCLa(56.38%)、CLaLa和MCC(20.36%)、CCC(12.55%)。精煉樟樹籽仁油的理化性質(zhì)達到國家食用植物油標準(GB 2716—2018)，室溫下為液態(tài)，是研發(fā)、生產(chǎn)功能食用油脂、營養(yǎng)補劑及特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品等產(chǎn)品的理想原料。