殷金蓮， 靳 毓

(1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，山西 朔州 036002； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

榛子別名山板栗，棰子。榛子果仁營養(yǎng)豐富，主要含脂肪50%～60%、蛋白質(zhì)12%～25%、糖類9%～12%。另外，榛子果仁中胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、維生素E和鈣、磷、鐵等微量元素含量也很豐富[1]，包含人體所需的8種必需氨基酸，有“堅(jiān)果之王”的稱號(hào)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)能催化無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有血管收縮活性的血管緊張素II[2-3]，ACE抑制劑通過抑制此反應(yīng)的進(jìn)行起到降低血壓的作用。具有ACE抑制作用的降壓藥物卡托普利、依那普利、貝那普利等對(duì)身體有一定副作用和限制使用范圍，因而近些年來尋求安全、無副作用的食源性ACE抑制肽引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，水稻、大豆、豌豆、小麥、松仁等植物蛋白[4-5]和一些海洋生物蛋白[6-7]的酶解產(chǎn)物均對(duì)ACE有一定的抑制作用。

目前,國內(nèi)對(duì)榛子的研究多是榛子油提取[8]、蛋白[9]提取、榛子酶解抗氧化肽制備與分離[10-11]等，而對(duì)榛子肽降血壓作用的研究很少。Eroglu等[12]初次證實(shí)了胃蛋白酶水解榛子蛋白的水解產(chǎn)物有一定的抗高血壓活性。Gülseren[13]研究比較了3種胃腸道蛋白酶和3種非胃腸道蛋白酶水解榛子蛋白所得產(chǎn)物的抗高血壓效果，結(jié)果顯示非胃腸道蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制效果較好。Liu等[14]研究了榛子ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系，證實(shí)ACE抑制肽是通過非競爭模式抑制ACE活性的。這些研究為榛子蛋白和多肽具有降血壓的生物活性提供了依據(jù)。

榛子粕作為榛子提油后的副產(chǎn)品，富含蛋白質(zhì)和各種營養(yǎng)素，由于榛子粕的適口性差，多被用作動(dòng)物飼料或作為廢棄物丟掉。本試驗(yàn)以榛子為原料，利用超聲波提取榛子油后得到副產(chǎn)品榛子粕，用中性蛋白酶酶解，研究其酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性并對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為榛子的生物功效、綜合利用和深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

榛子，市場采購；中性蛋白酶(酶活150 U/mg)，東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；酪蛋白磷酸肽，上海超研生物科技有限公司；馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(HHL)，上海酶聯(lián)生物研究所；ACE(酶活2 U/mg)，上海倍卓生物科技有限公司；石油醚、硼酸鈉、氯化鈉，均為分析純。

AF-I型電子恒溫水浴箱；分析天平；PM180R高速冷凍離心機(jī)(Alc International Srl)；PHS-3C精密pH計(jì)；UV-1700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；KH2200DB臺(tái)式數(shù)控超聲儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 榛子脫脂

先將榛子去殼、干燥、粉碎處理。稱取榛子粉10 g，按料液比1∶8加入石油醚， 在超聲波功率500 W、60℃條件下提取60 min，抽濾去除有機(jī)溶劑，用少量的石油醚洗滌濾渣2～3次，濾渣冷凍干燥即為榛子粕，-18℃冰箱冷凍保存待用。

1.2.2 榛子粕ACE抑制肽的制備

取榛子粕加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓?00℃水浴預(yù)處理30 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH，加入中性蛋白酶酶解一定時(shí)間后，水解液100℃滅酶15 s，5 000 r/min離心15 min，上清液即為含ACE抑制肽的酶解液。

1.2.3 ACE抑制率的測(cè)定

采用Cushman等[15]的方法并加以改進(jìn)。分別取75 μL 5 mmol/L HHL溶液、25 μL去離子水、25 μL酶解液，混合均勻后置于37℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min，加入25 μL 0.1 U/mL ACE酶液，37℃恒溫保持30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.25 mL 1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，再加入1.5 mL乙酸乙酯混合15 s，將混合液4 000 r/min離心10 min后，吸取1 mL乙酸乙酯層溶液，120℃烘干30 min，冷卻后再溶于3 mL去離子水中，混合均勻在228 nm處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算ACE抑制率。

ACE抑制率=(A1-A2)/(A1-A3)×100%

式中：A1為不加酶解液的溶液吸光度；A2為加入ACE和酶解液的溶液吸光度；A3為不加ACE的溶液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在酶用量0.3%、酶解溫度45℃、pH 7.5、酶解時(shí)間1.5 h條件下，考察底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ACE抑制率的影響

由圖1可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率呈增大趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5%后ACE抑制率增幅平緩。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，酶解釋放大量的活性肽分子，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí)，一方面沒有足夠的酶催化底物反應(yīng)，另一方面酶解液過于黏稠，整體濃度增大，影響酶解效率[16]。

2.1.2 酶用量的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶解溫度45℃、pH 7.5、酶解時(shí)間1.5 h條件下，考察酶用量對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶用量對(duì)ACE抑制率的影響

由圖2可知，隨著酶用量的增大，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率先增大后降低，當(dāng)酶用量達(dá)到0.3%時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大。原因可能是酶用量過大，酶解產(chǎn)物被進(jìn)一步分解成更小的肽分子或者游離氨基酸，使得ACE抑制率降低。

2.1.3 酶解溫度的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量0.3%、pH 7.5、酶解時(shí)間1.5 h條件下，考察酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對(duì)ACE抑制率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率先升高后降低，40℃時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大?？赡苁怯捎诖藭r(shí)酶活性較高，能水解蛋白質(zhì)釋放出較多的具有抑制ACE活性的肽分子，當(dāng)酶解溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)變性，酶構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致酶解效率降低[17]。

2.1.4 pH的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量0.3%、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間1.5 h條件下，考察pH對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)ACE抑制率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH 為7.5時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高。在不同pH條件下，酶活性不同，酶與蛋白質(zhì)底物的接觸位點(diǎn)也不同，對(duì)蛋白質(zhì)的酶解效果不同，因而導(dǎo)致酶解產(chǎn)物及其生物活性不同[7]。

2.1.5 酶解時(shí)間的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量0.3%、酶解溫度45℃、pH 7.5條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率先增大，酶解1.5 h后略有下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)水解度也增大，釋放出大量的 ACE 抑制肽，但酶解時(shí)間過長，一些ACE 抑制肽會(huì)被蛋白酶進(jìn)一步水解為無活性的小分子肽[18-19]或游離氨基酸，使得 ACE 抑制率下降。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定酶解時(shí)間1.5 h，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酶用量(B)、酶解溫度(C)和pH(D)為自變量，ACE抑制率(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

續(xù)表2

試驗(yàn)號(hào)ABCDY/%1810-1079.3519-101084.3120101086.57210-10-179.0222010-182.16230-10187.3324010189.4125000090.2826000091.0627000089.9228000090.3929000091.18

表3 回歸模型方差分析

注：*為P<0.05，差異顯著；**為P<0.01，差異極顯著。

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析得到相應(yīng)的二項(xiàng)式擬合方程:

Y=90.57+0.65A+1.08B+3.04C+3.38D+0.93AB+0.39AC-0.047AD+ 0.16BC-0.27BD+0.50CD-2.31A2-3.05B2-5.48C2-2.49D2

各酶解因素影響酶解產(chǎn)物ACE抑制率的顯著程度順序?yàn)镈>C>B>A，即pH>酶解溫度>酶用量>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中B、C、D達(dá)到極顯著水平，A達(dá)到顯著水平，A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平，各因素交互作用對(duì)ACE抑制率的影響均不顯著。

經(jīng)Design-Expert軟件模擬分析，得到酶解榛子粕制備ACE抑制肽的最佳條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.2%、酶用量0.32%、酶解溫度41.6℃、pH 7.35，ACE抑制率為92.399 4%。在實(shí)際操作過程中為了方便與可控，將最佳條件各指標(biāo)數(shù)值修正為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、酶用量0.3%、酶解溫度40℃、pH 7.5，在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，ACE抑制率的平均值為91.76%，相對(duì)誤差為0.69%(<1%)。說明用響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)得到的理論值與實(shí)際值擬合度高，用此模型對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化是合理可行的，結(jié)果也是可靠的。

3 結(jié) 論

榛子脫脂后得到富含蛋白質(zhì)的榛子粕，經(jīng)中性蛋白酶酶解后的酶解產(chǎn)物榛子多肽具有ACE抑制活性。以ACE抑制率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析得到的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，酶用量0.3%，酶解溫度40℃，pH 7.5，酶解時(shí)間1.5 h。在最佳條件下，ACE抑制率為91.76%。