禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的一種具有傳染性的禽類腫瘤性疾病。J 亞群ALV（ALV-J）自1999 年在我國發(fā)現(xiàn)以來，對我國白羽肉雞、蛋用型雞、黃羽雞（我國地方品種雞）造成嚴(yán)重危害，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時也嚴(yán)重威脅我國家禽種源安全。ALV-J 通過其囊膜表面蛋白（gp85）與細(xì)胞受體chNHE1 的特異性結(jié)合啟動感染，而這種結(jié)合能力的強(qiáng)弱，可直接影響病毒侵入宿主細(xì)胞的水平，同時病毒侵入機(jī)制的闡明為研究抗病新技術(shù)也非常重要。我們前期的研究已證明，chNHE1 的第一個膜外環(huán)的A28～E39 位氨基酸是受體的最小功能域，其與gp85 蛋白直接結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入，但gp85 蛋白如何與受體結(jié)合，哪些區(qū)域或氨基酸參與受體的結(jié)合，還不清楚。

近期在《Journal of Virology》發(fā)表了“The bipartite sequence motif in the N- and C-terminal of gp85 of Subgroup J avian leukosis virus plays a crucial role in receptor-binding and viral entry”的研究論文。該研究鑒定出ALV-J gp85的N端38-131氨基酸和C端的159-283氨基酸是影響gp85 蛋白與chNHE1 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。此外，gp85 的糖基化位點(diǎn)Gly116 和Gly219 和半胱氨酸位點(diǎn)Cys60和Cys197在受體結(jié)合和病毒進(jìn)入中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明ALV-J 進(jìn)入宿主細(xì)胞的分子機(jī)制，為ALV-J的防控提供了新的抗病毒靶點(diǎn)。

為鑒定ALV-J gp85 蛋白與細(xì)胞受體chNHE1 的結(jié)合域，該研究首先表達(dá)了可溶性的具有生物學(xué)活性的gp85 蛋白，利用流式細(xì)胞術(shù)建立了檢測gp85 蛋白與chNHE1結(jié)合能力的方法。采用HA標(biāo)簽逐段替換gp85蛋白全序列的策略，構(gòu)建并表達(dá)了33 種嵌合gp85 蛋白。受體結(jié)合和固相結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明：HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替換，顯著影響了gp85 蛋白與chNHE1 的結(jié)合能力。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，該研究將純化的33 種嵌合gp85 蛋白與RCAS（J）-EGFP 標(biāo)簽病毒進(jìn)行了病毒阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果同樣表明，HA5-14（aa38-131）和HA18、HA20-31（aa159-283）的替換，導(dǎo)致嵌合gp85 蛋白不能夠阻斷RCAS（J）EGFP 標(biāo)簽病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。綜上，gp85 蛋白的第38-131位和159-283位氨基酸是影響ALV-J與受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域。

為進(jìn)一步探究ALV-J gp85蛋白的糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸位點(diǎn)對其結(jié)合受體結(jié)合力的影響，該研究將gp85 蛋白的第38-131 位和159-283 位氨基酸中的糖基化位點(diǎn)和半胱氨酸位點(diǎn)回復(fù)突變，然后利用流式細(xì)胞術(shù)和固相結(jié)合證實(shí)糖基化位點(diǎn)Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60 和Cys197 影響ALV-J 與受體的結(jié)合能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證這2 個糖基化位點(diǎn)和2 個半胱氨酸對ALV-J 與受體結(jié)合、進(jìn)入靶細(xì)胞的作用，該研究構(gòu)建糖基化位點(diǎn)（Gly116 和Gly219）和半胱氨酸（Cys60 和Cys197）突變的4種重組毒（ΔN6，ΔN11，ΔC3和ΔC9）和對應(yīng)回復(fù)突變的4 種重組毒（rN6、rN11、rC3 和rC9）。病毒拯救結(jié)果表明，僅回復(fù)突變的4 種重組毒rN6、rN11、rC3 和rC9 成功拯救；進(jìn)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rN6、rN11、rC3 和rC9 重組病毒能夠有效進(jìn)入DF-1細(xì)胞。這些結(jié)果表明，ALV-J gp85的糖基化位點(diǎn)Gly116和Gly219、半胱氨酸Cys60和Cys197對于受體結(jié)合和病毒進(jìn)入至關(guān)重要。

目前還沒有用于禽白血病防控的疫苗或有效藥物，該病主要通過種群進(jìn)化來控制，而疾病凈化是一項長期而復(fù)雜的過程，費(fèi)時費(fèi)力效率低，迫切需要建立新型有效的防控技術(shù)。該研究結(jié)果有利于闡明ALVJ入侵宿主細(xì)胞的分子機(jī)制，為研究抗ALV-J感染雞的研究提供了重要基因編輯靶點(diǎn)，為抗病育種提供重要技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。