沈也馳，李 昕，徐正中，夏愛(ài)鴻，焦新安，陳 祥

（1. 揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009； 2. 揚(yáng)州大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子（動(dòng)物源）控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）引起的人獸共患慢性傳染病[1]。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，產(chǎn)生以細(xì)胞免疫為主的抗結(jié)核免疫，并且病原體主要通過(guò)飛沫經(jīng)呼吸道傳播，或經(jīng)消化道和皮膚黏膜損傷侵入其他機(jī)體，侵犯肺、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官，引起結(jié)核病，其中以肺結(jié)核最為常 見(jiàn)[2]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)[3]，2017年全球有120～140萬(wàn)例結(jié)核病死亡患者，估計(jì)有900～1110萬(wàn)例新發(fā)病患，覆蓋所有國(guó)家和年齡層。雖然全球結(jié)核病的致死率和發(fā)病率均呈下降趨勢(shì)，但是由于HIV/AIDS的蔓延和流行、發(fā)展中國(guó)家人口激增和流動(dòng)、耐多藥結(jié)核病的產(chǎn)生等原因，結(jié)核病仍為導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率的全球十大單一感染性疾病之一[4]。

目前，結(jié)核病診斷方法主要有細(xì)菌學(xué)檢查、分子生物學(xué)檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)[5]。在低收入和高發(fā)結(jié)核病人群地區(qū)，細(xì)菌學(xué)檢查是應(yīng)用較廣泛的結(jié)核病診斷方法之一，具有操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。但該方法也存在較多缺陷，其中痰涂片法陽(yáng)性檢出率低，菌培養(yǎng)法檢測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度低，以細(xì)菌學(xué)檢查作為結(jié)核病的唯一診斷方法易導(dǎo)致漏診和較高的誤診率，使病人錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，如PCR、核酸雜交法等，用于結(jié)核分枝桿菌及其特異性DNA片段的檢測(cè)，該類(lèi)檢測(cè)方法速度快、準(zhǔn)確率高，在近年快速興起，但是需要相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備。免疫學(xué)檢測(cè)具有較好的發(fā)展前景，其中結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）在上個(gè)世紀(jì)是快速診斷活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的唯一手段[6]。TST問(wèn)世已有一百多年，應(yīng)用十分廣泛，雖敏感性高卻特異性差，檢測(cè)結(jié)果具有較高的假陽(yáng)性率。近年來(lái)，γ干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）不斷發(fā)展并應(yīng)用于結(jié)核病診斷，該試驗(yàn)所涉及的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）因具有良好檢測(cè)特性，為結(jié)核病的診斷提供了一種新的手段。

1 IGRA 和ELISPOT 檢測(cè)技術(shù)

IGRA是一種結(jié)核分枝桿菌感染的體外檢測(cè)方法，基于免疫應(yīng)答機(jī)制，通過(guò)檢測(cè)分泌γ干擾素水平進(jìn)而檢測(cè)是否感染結(jié)核分枝桿菌，目前商品化診斷方法包括QuantiFERON-TB Gold試劑盒和T-SPOT.TB試劑盒，其檢測(cè)技術(shù)分別為ELISA檢測(cè)技術(shù)和ELISPOT檢測(cè)技術(shù)[7]。

ELISPOT是在單細(xì)胞水平高通量檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的一項(xiàng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，是ELISA檢測(cè)技術(shù)的延伸[8]。通過(guò)抗體固定所分泌的細(xì)胞因子，利用酶顯色反應(yīng)，使對(duì)應(yīng)位點(diǎn)顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，直接通過(guò)顯微鏡人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò) ELISPOT分析儀對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法具有較高的敏感性和特異性，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞術(shù)較低，已被廣泛用于自身免疫檢測(cè)、器官移植檢測(cè)、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測(cè)、T細(xì)胞功能研究、腫瘤研究、傳染病的研究和檢測(cè)等。

2 ELISPOT 在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

隨著對(duì)結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的不斷探索和智能分析技術(shù)飛速發(fā)展，ELISPOT在結(jié)核病診斷中發(fā)揮越來(lái)越多的作用。2008年商品化試劑盒T-SPOT.TB（Oxford Immunotec, Oxford，UK）獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)[9]，2010年我國(guó)食品藥品監(jiān)督總局批準(zhǔn)進(jìn)口并應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。其快速、靈敏的特征在臨床中為原發(fā)性結(jié)核、肺外結(jié)核及菌陰肺結(jié)核等多種結(jié)核病的輔助診斷提供重要依據(jù)。基于ELISPOT技術(shù)的其他產(chǎn)品在歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家也已獲批，并作為活動(dòng)性和潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染篩查的重要檢測(cè)手段[10-11]。國(guó)內(nèi)也有實(shí)驗(yàn)室建立了針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌感染的抗原特異性ELISPOT檢測(cè)方法，并研制相應(yīng)ELISPOT檢測(cè)試劑盒[12-14]。

2.1 ELISPOT在活動(dòng)性結(jié)核診斷中的應(yīng)用ELISPOT檢測(cè)技術(shù)中所使用的抗原是利用位于結(jié)核分枝桿菌基因組的RD-1基因編碼的特異性抗原，在卡介苗（bacillus Calmette Guérin, BCG）和大部分環(huán)境分枝桿菌都缺少，相較于TST中使用的純化蛋白質(zhì)衍生物（purfied protein derivatives，PPDs）更具特異性[15]。同時(shí)，ELISPOT將單個(gè)細(xì)胞可視化，相比于傳統(tǒng)ELISA靈敏度提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。ELISPOT檢測(cè)技術(shù)極大程度地提高了結(jié)核病診斷的靈敏度和特異性。

目前，已有較多研究對(duì)ELISPOT在活動(dòng)性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)，Diel等[9]的一項(xiàng)Meta分析中，研究對(duì)象均為成年人，并有明確的活動(dòng)性結(jié)核感染的微生物學(xué)證據(jù)，T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感性為89%，特異性為86%，對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病患者T-SPOT.TB的陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)高于涂片、核酸和結(jié)核抗體法，并且無(wú)論是對(duì)肺結(jié)核、肺外結(jié)核還是合并多種結(jié)核，T-SPOT.TB均能夠很好的檢 出[16]。在結(jié)核病診斷的臨床應(yīng)用上，T-SPOT.TB的敏感性較高，其后通過(guò)ROC曲線分析T-SPOT.TB的診斷價(jià)值最大[17]。ELISPOT檢測(cè)技術(shù)可用于建立排除活動(dòng)性結(jié)核的診斷，包括對(duì)2～3周以上不明原因發(fā)熱病人的結(jié)核感染排篩、對(duì)BCG接種人群的結(jié)核感染篩查等。

2.2 在LTBI診斷中的應(yīng)用LTBI是指宿主感染結(jié)核分枝桿菌后未發(fā)病，無(wú)活動(dòng)性結(jié)核臨床癥狀、影像學(xué)改變和細(xì)菌學(xué)證據(jù)，但是傳統(tǒng)TST和IGRA檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的一種特殊狀態(tài)，若不及時(shí)診斷，將有5%～10%的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核[10]。當(dāng)前全球應(yīng)對(duì)結(jié)核病的戰(zhàn)略中，結(jié)核病研究重點(diǎn)之一是減少17億LTBI人群發(fā)病率，因此，對(duì)LTBI 的診斷尤為重要。

ELISPOT檢測(cè)技術(shù)對(duì)LTBI的診斷和治療有一定效果[18]。Doan等[7]利用Bayesia模型，納入157項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析，在未接種BCG且具有免疫力的成人中，TST和T-SPOT.TB的敏感性分別為84%和68%，特異性分別為100%和97%，T-SPOT.TB與QFT-GIT相比，特異性相似且敏感性更高（68%比52%）。研究顯示TST結(jié)果受是否接種BCG、是否免疫受損和年齡等影響較大，而IGRA受上述影響較小，表明ELISPOT在LTBI診斷中能夠更加準(zhǔn)確[19-20]。目前，該方法已應(yīng)用在一些結(jié)核病低發(fā)病率的國(guó)家，尤其是檢查與活動(dòng)性結(jié)核病患者有過(guò)接觸的人群。

2.3 在HIV感染人群中的應(yīng)用結(jié)核病是HIV感染患者中最常見(jiàn)的致死原因，在全球合并HIV感染的結(jié)核病死亡患者約有30萬(wàn)[3]，因此提高合并HIV感染的結(jié)核病診斷水平異常重要。

目前對(duì)于HIV患者感染結(jié)核分枝桿菌診斷主要依賴(lài)TST，但由于HIV患者處于免疫抑制狀態(tài)，TST檢測(cè)診斷不敏感，且癥狀及胸片往往不典型，增加了診斷的難度。而T-SPOT.TB不受CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)水平的影響，避免了HIV感染后細(xì)胞免疫功能受損而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，可對(duì)HIV感染者并發(fā)結(jié)核進(jìn)行篩查。研究顯示，ELISPOT檢測(cè)技術(shù)是否受患者免疫狀態(tài)的影響，目前仍存在較大爭(zhēng)議，但是其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度普遍更高，在一定程度上能夠有助于HIV患者感染結(jié)核病早期快速診斷[21-22]。

2.4 在動(dòng)物結(jié)核病診斷中的應(yīng)用結(jié)核病除了感染人外，還能感染50多種哺乳動(dòng)物和20多種禽類(lèi)[2]。其中，由牛分枝桿菌感染引起的牛結(jié)核病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health，OIE）列為需通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。目前，國(guó)內(nèi)外均建立了牛γ干擾素ELISPOT檢測(cè)牛結(jié)核的方法并不斷改進(jìn)，Parthasarathy等[23]通過(guò)換用重組ESAT-6-CFP-10融合蛋白，提高了ELISPOT檢測(cè)牛分枝桿菌感染的特異性和靈敏度。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)牛結(jié)核診斷研究，篩選到牛γ干擾素單克隆抗體，建立了牛γ干擾素ELISA、ELISPOT 檢測(cè)方法，并使用建立的ELISPOT檢測(cè)方法對(duì)30頭奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)，結(jié)果與BOVIGAMTM牛結(jié)核ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果有較高符合率[14,24-25]。

3 ELISPOT 應(yīng)用于結(jié)核病診斷的局限性

盡管基于ELISPOT檢測(cè)技術(shù)的IGRA對(duì)結(jié)核病診斷具有重大意義，但是仍然具有一定局限性。首先，ELISPOT能夠檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染，但是其斑點(diǎn)數(shù)不能作為區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)研究表明T-SPOT.TB在LTBI流行地區(qū)的檢測(cè)特異性為46%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為47%、陰性預(yù)測(cè)值為84%，不能直接判定活動(dòng)性結(jié)核病，同時(shí)缺乏足夠的敏感性，因此在LTBI流行地區(qū)不能單獨(dú)用于排除活動(dòng)性結(jié)核病[26]；其次，ELISPOT檢測(cè)結(jié)果與環(huán)境中暴露的結(jié)核分枝桿菌顯著相關(guān)，并與暴露強(qiáng)度呈正相關(guān)，若待檢人員與活動(dòng)性結(jié)核病人共處一室，則每增加一小時(shí)，ELISPOT的陽(yáng)性率增加1.05%[27]。因此檢測(cè)結(jié)果的單一判斷標(biāo)準(zhǔn)可能造成誤診，需要針對(duì)不同人群和具體地區(qū)有所調(diào)整；再次，ELISPOT檢測(cè)技術(shù)需要分離外周血淋巴細(xì)胞，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作要求較高，并且其檢測(cè)結(jié)果不能顯示臨床患者病變部位，需要結(jié)合胸片進(jìn)行臨床的判斷；最后，由于檢測(cè)成本較高，使得該方法在結(jié)核病疫情嚴(yán)重或中低收入地區(qū)較難推廣和應(yīng)用。

4 小結(jié)

T-SPOT.TB利用ELISPOT檢測(cè)技術(shù)，相較于其他結(jié)核病診斷方法，在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染人群和免疫力低下的人群中具有相對(duì)較高的診斷靈敏度和特異性，檢測(cè)時(shí)間短，且ELISPOT檢測(cè)結(jié)果與是否接種卡介菌無(wú)較大關(guān)聯(lián)，檢測(cè)結(jié)果較傳統(tǒng)的TST更加可靠。但是，對(duì)于結(jié)核病診斷該技術(shù)也存在缺陷，如對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者和潛伏性結(jié)核感染者的區(qū)分沒(méi)有精確標(biāo)準(zhǔn)；存在一定假陽(yáng)性結(jié)果；由于T-SPOT.TB試劑盒價(jià)格昂貴，在經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的地區(qū)很難推廣。為了彌補(bǔ)該方法上述局限性，提高結(jié)核病診斷效率，可以與其他診斷方法聯(lián)合使用，或加入具有協(xié)同作用的細(xì)胞因子刺激γ干擾素的釋放，或同時(shí)檢測(cè)γ干擾素和其他相關(guān)細(xì)胞因子等。同時(shí)，該技術(shù)在動(dòng)物結(jié)核病診斷中也具有巨大的潛在價(jià)值。目前，歐美國(guó)家已將ELISPOT檢測(cè)技術(shù)作為結(jié)核病診斷的一種重要的輔助手段，而我國(guó)結(jié)核病流行，BCG接種率高并且地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展不均衡，切實(shí)結(jié)合國(guó)情，合理發(fā)展并推廣該技術(shù)，使其最大程度地發(fā)揮在結(jié)核病診斷上的優(yōu)勢(shì)。