林凱麗,劉梅軒,麻昊然,潘思丹,喬紅偉,高虹

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京 100021)

目前,新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)在全球呈現(xiàn)爆發(fā)式流行,截止2020 年7 月初,全球已經(jīng)有196 個國家出現(xiàn)COVID-19 病例,累計確診病例達到1163 萬人。 在COVID-19 暴發(fā)初期,對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的生物學特性、流行病學特征、致病性、COVID-19 臨床表現(xiàn)等尚不明確,預防和治療手段也亟待解決,為加強對SARS-CoV-2 的認識,有效開發(fā)特異性診斷試劑,系統(tǒng)的評價機體的免疫網(wǎng)絡及組織病變,為臨床診斷、預防與治療、疫苗與藥物的篩選提供詳細的參考資料,開展病毒分離和動物感染實驗迫在眉睫。 根據(jù)目前所掌握的基本信息,該病原暫按照病原微生物危害程度分類第二類病原微生物進行管理,病毒培養(yǎng)和動物感染實驗均應當在生物安全三級實驗室內(nèi)操作[1]。

為應對新發(fā)再發(fā)傳染病、防范生物恐怖襲擊、防御生物武器攻擊,我國已經(jīng)規(guī)劃并建成一批高等級生物安全實驗室,作為國家生物安全體系的基礎(chǔ)支撐平臺,為人口健康與動物衛(wèi)生領(lǐng)域開展科研、生產(chǎn)和服務提供重要保障條件[2]。 在對SARS-CoV-2 有限認知的前提下,如何迅速、高效、有序的開展SARS-CoV-2 應急實驗活動,最大程度的控制潛在風險,保護實驗人員健康與安全,保障實驗室正常運轉(zhuǎn),除了硬件設(shè)施外,規(guī)范化的管理措施也是生物安全三級實驗室安全運行的重要保障。

1 生物安全管理措施

系統(tǒng)、規(guī)范化的管理措施是生物安全三級實驗室高效、有序運行的重要保障,是降低實驗室意外事故發(fā)生的關(guān)鍵要素。 開展實驗活動前,實驗人員應充分了解實驗室活動涉及的任何危險,由于人類對SARS-CoV-2 的有限認知,無法對其進行充分的風險評估,因此管理部門應采取恰當?shù)墓芾泶胧?并為實驗人員提供如何在風險最小情況下進行工作的詳細指導[3],包括人員管理、活動管理、設(shè)施設(shè)備管理、消毒滅菌及意外事故處理等。

1.1 人員管理

在SARS-CoV-2 應急研究工作中,人員管理是保證實驗室安全、有效運行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 開展實驗活動前,首先應成立法人負責的應急團隊,包括技術(shù)負責人、安全管理人員和項目負責人在內(nèi),落實組織管理責任,密切追蹤疫情的發(fā)展情況,完善風險評估、制定研究方案、分析研究結(jié)果、協(xié)調(diào)應急物資、調(diào)撥實驗人員,還要密切關(guān)注實驗人員的工作狀態(tài),及時做好人員的心理疏導和技術(shù)培訓。

項目組成員最好具有動物生物安全三級實驗室研究背景,熟練掌握病毒培養(yǎng)、動物飼養(yǎng)和感染的基本操作程序,充分了解實驗動物的習性,降低抓傷咬傷、動物逃逸等風險,必要時可佩戴防抓咬手套。 非人靈長類是研究SARS-CoV-2 理想的實驗動物之一,由于其體格較大、生理結(jié)構(gòu)復雜,芯片植入、肺泡灌洗、動物解剖等操作對實驗人員的技術(shù)造成極大的挑戰(zhàn),因此要求實驗人員具有扎實的操作基礎(chǔ)。 其次,加強人員持續(xù)培訓,不僅能夠鞏固人員的實驗基礎(chǔ),還能夠提高警惕性、加強風險意識,培訓重點不僅要包括人員防護、實驗室風險、意外事故處理、廢棄物的處置、清場消毒和緊急撤離等方面,還要階段性總結(jié)實驗室內(nèi)基本情況,及時反思前期出現(xiàn)的問題。 再次,管理人員要關(guān)注人員的身體健康和心理健康,通過交流與實驗人員建立良好的互信關(guān)系,充分了解實驗人員所承受得工作壓力和生活壓力,使其避免受到任何不利于其工作質(zhì)量的壓力或影響。

在應急工作中,往往時間緊、任務重,多個核心實驗室同時開展試驗活動,應有制度明確規(guī)定不同核心實驗室的研究人員退出時間需錯開半小時以上,以使公共區(qū)域得到充分自凈。 由于疾病流行初期,對COVID-19 缺乏有效的預防和治療方案,因此實驗活動前,人員要留取本底血清;實驗過程中,階段性采集咽拭子檢測核酸,如發(fā)生意外事故,一旦檢測結(jié)果呈陽性或出現(xiàn)與SARS-CoV-2 有關(guān)的臨床癥狀時,應立即上報、隔離、就診。

1.2 實驗活動管理

SARS-CoV-2 與SARS-CoV 相似性達到79.6%,通過細胞膜表面ACE2 受體進入細胞[4],我國暫時按照第二類病原微生物管理。 值得注意的是,《SARS-CoV-2 實驗室生物安全指南》 中明確指出未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料操作可在生物安全二級實驗室中操作,同時采用三級實驗室的個人防護[1],因此實驗室應急管理可參考SARS-CoV,遵循 “防護加強、程序減少” 的基本原則。

SARS-CoV-2 主要傳播途徑是呼吸道飛沫和接觸傳播,不排除氣溶膠、消化道和結(jié)膜感染等傳播途徑,因此除生物安全三級實驗室基本的防護外,實驗人員必須佩戴一次性N95 醫(yī)用防護口罩、護目鏡或者一次性面罩,佩戴N95 口罩可能存在邊緣漏氣的情況,因此每次佩戴時需要進行簡易的吹氣檢驗,根據(jù)操作者鼻部尺寸自行調(diào)整防護口罩的鼻金屬夾,吹一口氣,感覺口罩邊緣是否漏氣,保證呼出和吸入氣體確實通過口罩過濾。 實驗人員每年需要進行N95 口罩的個體適配性檢測,應同時適配兩款以上的口罩,當長時間開展實驗活動時可交替使用,避免人員臉部壓痕難以恢復的情況。 在實際使用過程中,護目鏡不僅容易起霧,而且反復消毒會導致鏡片模糊,影響人員操作安全和舒適性,因此推薦佩戴一次性防護面罩。 當實驗人員進行非人靈長類動物解剖實驗時,可能存在因動物咳嗽或排泄形成的大量氣溶膠或噴濺現(xiàn)象,實驗人員可以佩戴半身電送風正壓防護裝置,外穿一次性手術(shù)反穿衣,方便污染后隨時更換。

應急工作期間,實驗室仍然要按管理要求執(zhí)行實驗活動申請、審批制度,管理部門嚴格審查風險評估和標準操作程序、人員資質(zhì)、病原種類、動物種類和實驗活動內(nèi)容,鑒于實驗活動較多,同一項目可提交一個較長周期的實驗室使用申請,減少項目組的申請壓力,但是每次進動物前,項目組均需要提交經(jīng)過實驗動物管理委員會( IACUC) 批準的動物使用申請,確保管理部門掌握實驗活動進展和動物飼養(yǎng)情況,合理安排飼養(yǎng)籠位,協(xié)調(diào)各項目組實驗時間。 實驗活動中,病毒培養(yǎng)要嚴格控制單次的操作數(shù)量,建議少量多次,縮短操作時間,生物安全柜內(nèi)從左到右依次分為潔凈區(qū)、工作區(qū)和污物區(qū),不能遮擋排風口以免影響氣流或引發(fā)設(shè)備報警。動物感染實驗可以根據(jù)單次感染動物的數(shù)量,增加進入人數(shù),比如平時進入2 個人操作3 h 左右,應急期間可同時進入3～4 個人縮短操作時間,或者輪流操作,降低因人員疲倦發(fā)生意外的概率,每次進入時間嚴格控制在4 h 以內(nèi)。 為了減少人員在實驗室內(nèi)的停留時間,實驗前要制定完整的方案,包括給藥劑量、感染劑量和給藥途徑等,做好充分的實驗準備;實驗過程中,除病理解剖、動物臨床觀察等必須現(xiàn)場完成的記錄外,儀器設(shè)備記錄、感染性材料記錄等可在離開實驗室后補齊。

1.3 設(shè)施設(shè)備管理

設(shè)施設(shè)備是開展SARS-CoV-2 實驗活動的基礎(chǔ)保障,在實驗室正常運轉(zhuǎn)的情況下,開關(guān)門、局部排風設(shè)備的啟停以及房間溫濕度的變化等因素均能夠引起房間的壓力波動,在滿足現(xiàn)有生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范和設(shè)備生物安全性能評價技術(shù)規(guī)范的前提下,可根據(jù)實際情況提高設(shè)施運行的參數(shù),以增強實驗室對壓力波動的抗干擾能力,如增大房間換氣次數(shù),增加實驗室換氣次數(shù)到每小時15次或每小時20 次,通過增大換氣次數(shù)提高房間凈化能力。

病毒培養(yǎng)、動物觀察和解剖等常用設(shè)備是生物安全柜和負壓解剖臺,選用II 級A 型以上級別生物安全柜,部分生物安全柜可通過調(diào)節(jié)送排風按鈕增大系統(tǒng)送排風量,在生物安全柜內(nèi)的工作開始前和結(jié)束后,增加風機運行時間至10 min,保證工作前氣流穩(wěn)定和工作結(jié)束后安全柜內(nèi)空氣的凈化程度,工作結(jié)束后,增加紫外燈照射時間。 由于非人靈長類體格較大、呼吸量較大,感染后呼出氣體能夠產(chǎn)生氣溶膠,建議使用生物安全型飼養(yǎng)設(shè)備,可增加設(shè)備換氣次數(shù),降低實驗人員飼養(yǎng)過程中的暴露風險。

1.4 清場消毒

實驗室清場消毒是保護實驗人員、實驗環(huán)境和外部環(huán)境的重要環(huán)節(jié)。 所有移出實驗室的物品都需要經(jīng)過消毒處理,注明廢棄物類別、處理時間、處理人員等基本信息,放到專門設(shè)計的、專用的和有標識的危險廢物處置容器中[1],集中回收后按照要求處理。 高壓蒸汽滅菌是生物安全實驗室消毒滅菌的首選方法,適用于實驗室內(nèi)產(chǎn)生的廢棄物、動物尸體、墊料等,對于不能高壓的物品,比如儀器設(shè)備、動物標本等使用化學消毒法。

由于SARS-CoV-2 傳染性強、生物學特性尚不明確,建議在實驗活動操作中增加消毒頻次,延長消毒劑作用時間,有效氯含量為0.55%的含氯消毒劑是新型冠狀病毒的首選消毒劑[5]。 在操作感染性材料或動物解剖實驗活動前,需要在操作臺面鋪一次性吸水墊,表面噴灑不易揮發(fā)的消毒劑,一旦發(fā)生感染性材料的滴落,能夠被迅速吸附消毒。 實驗過程中,操作人員切勿將手頻繁移出生物安全柜,操作結(jié)束后對手部進行消毒,更換外層手套后,才能移出生物安全柜。

甲醛熏蒸是目前公認的能夠殺死所有微生物的消毒方法,由于其極大的刺激性和致癌風險以及對設(shè)施設(shè)備的損害,一般情況下不推薦使用,但是當實驗室設(shè)備故障出現(xiàn)壓力逆轉(zhuǎn)等現(xiàn)象,有潛在泄露風險時,應該立即終止實驗,封閉實驗室,在室溫不低于21℃、 相對濕度70% 的條件下使用甲醛(40%)10 mL/ m3熏蒸4 h 以上,作用時間需達到8 h 以上[1],保障實驗人員、實驗環(huán)境和外界環(huán)境的安全。

1.5 意外事故的預防與處理

在ABSL-3 實驗室內(nèi)從事動物實驗活動時,潛在的意外事故包括動物實驗器材扎傷,動物抓傷、咬傷,感染性物質(zhì)溢灑,動物逃逸,個人防護裝備污染等,因此實驗室應制定恰當?shù)念A防措施和處置方案。 比如為了避免人員扎傷,注射器排空時禁止蓋帽,可以在針頭上扎一個酒精棉球,吸附排空過程產(chǎn)生的氣溶膠;為了避免動物抓傷、咬傷,抓取動物時需佩戴防抓咬手套或者在動物麻醉狀態(tài)下進行操作;為防止感染性物質(zhì)溢灑而引起實驗室污染,核心間應配備溢灑工具箱( 內(nèi)含毛巾、消毒劑、鑷子、量杯、禁止進入的標識等),實驗人員進入核心間后應配置消毒液,將毛巾浸泡在里面,一旦發(fā)生感染性物質(zhì)溢灑,立即用浸有消毒液的毛巾覆蓋,消毒防護裝備表面后打開紫外燈離開實驗室,待核心間充分自凈后再返回處理;為了防止動物逃逸,核心間應配備捕捉桶和捕捉網(wǎng),分別用于捕捉嚙齒類動物和體型較大的動物,嚙齒類動物跌落至地面時會有3 秒鐘左右的反應延遲,實驗人員應充分利用該機會進行捕捉。

2 結(jié)語

在全國爆發(fā)COVID-19 疫情的時期,生物安全三級實驗室為人類認識病毒、有效開發(fā)診斷試劑、系統(tǒng)評價機體的免疫網(wǎng)絡及組織病變等方面提供了重要的硬件設(shè)施保障條件。 但是再好的硬件設(shè)施保障、再完美的防護條件,在實際操作層面上是無法取代人員自身的素質(zhì)和責任心,完善的管理措施能夠有效地預防實驗室生物安全事故的發(fā)生,是實驗室安全、穩(wěn)定、有效運行的重要保障。 因此,我們需要不斷完善應急措施,從實驗人員、實驗活動、設(shè)施設(shè)備、清場消毒和意外事故的預防與處理等幾個方面加強實驗室管理,保障實驗室安全、穩(wěn)定、有效的運行,為早日戰(zhàn)勝疫情貢獻自己的力量。