黃 科， 張建瑩， 鄧慧芬， 洪旭然， 李 凱

(深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045)

酸性除草劑多用于小麥、水稻等的雜草防治，但其極易溶解于地表水中，可對人類和生物體造成嚴(yán)重危害。典型的酸性除草劑有苯氧羧酸類、芳氧苯氧丙酸酯類、吡啶氧羧酸類等。該類除草劑以2,4-滴最為著名，其他常用酸性除草劑如麥草畏、吡氟禾草靈、氟吡禾靈、2甲4氯、二氯吡啶酸均為2,4-滴優(yōu)化而來[2]。我國對2,4-滴、氟吡禾靈、高效氟吡甲禾靈等在蔬菜上均有限量要求[3]，分別為0.05～0.5、0.2、0.1～0.2 mg/kg。4-氯苯氧乙酸禁止在豆芽生產(chǎn)中使用。但是更多的酸性除草劑在蔬菜上并無限量要求。然而日本、歐盟對除草劑的使用要求卻較為嚴(yán)格，大多酸性農(nóng)藥均有限量要求。日本和歐盟要求2甲4氯在蔬菜上的限量為0.1、0.05～0.1 mg/kg，氯氟吡氧乙酸在蔬菜上的限量為0.04～0.05、0.05 mg/kg。因此，建立實用高效的酸性除草劑多殘留檢測方法尤為重要，可為蔬菜安全監(jiān)測及限量制定提供參考。

目前,針對酸性除草劑在不同基質(zhì)中的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[4 - 5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6 - 7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[8]、液相色譜法(LC)[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10 - 11]和毛細(xì)管電泳法(CE)[12]等。其中,LC-MS/MS法因具有靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、可實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中多種痕量物質(zhì)測定等優(yōu)點,在農(nóng)藥殘留檢測方面應(yīng)用廣泛。QuEChERS方法步驟少，試劑消耗少，目標(biāo)化合物損失少，適用農(nóng)藥范圍廣，是多殘留分析的前處理首選方法。本研究對常用的苯氧羧酸類、芳氧苯氧丙酸酯類、吡啶氧羧酸類等幾大類酸性除草劑，選取其中最典型的，如：2,4-滴、麥草畏、氟吡禾靈、溴苯腈、雙草醚、二氯吡啶酸等20種化合物為研究對象，通過優(yōu)化QuEChERS方法，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性及定量方法。該方法的建立，可以滿足日常檢測及篩查蔬菜中酸性除草劑工作，具有實用意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

8050液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本，Shimadzu公司)；均質(zhì)儀(美國，Omni公司)；旋渦振蕩儀(德國，Heidolph公司)；往復(fù)震蕩儀(日本，Yamato公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國，Sigma公司)。

20種酸性除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%(德國Dr.E公司)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解度選用甲醇溶劑配制濃度為1 000 mg/L的各個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再移取適量單儲備液使用甲醇配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于-30 ℃避光存放。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(德國Merck公司)；無水MgSO4、NaCl均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)；石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)(美國Supelco公司)。水為Milli-Q(美國Millipore公司高純水發(fā)生器制備)超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理稱取10.0 g(精確至0.01 g)蔬菜樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 0.5%甲酸乙腈(V/V)，在28 000 r/min下均質(zhì)1 min，加入4.0 g MgSO4，1.0 g NaCl，加蓋迅速搖勻，振蕩提取5 min，9 500 r/min 離心5 min。上清液待凈化。

1.2.2 樣品凈化取6 mL上清液，移入含900 mg MgSO4，50 mg GCB吸附劑的15 mL具塞離心管中，搖勻后，振蕩3 min，以9 500 r/min 離心5 min。取上清液1 mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，供LC-MS/MS測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm；美國Agilent公司)。流動相A為0.01%甲酸水溶液(V/V)，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.00 min，5%B；1.00～2.00 min，5%～50%B；2.00～6.00 min，50%～100%B；6.00～6.10 min，100%～5%B；6.10～9.00 min，5%B。流速：0.3 mL/min。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。離子源：電噴霧離子源(ESI)。掃描方式：正負(fù)離子掃描。離子源溫度：300 ℃。霧化氣流速：3.0 L/min。干燥氣流速：10.0 L/min。脫溶劑管溫度:200 ℃。加熱模塊溫度：400 ℃。加熱氣流速：10.0 L/min。離子源電壓：4.0 kV。采用分段多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。分辨率：單位分辨率。駐留時間：30 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

選擇水-甲醇、水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.01%甲酸水溶液-甲醇、0.01%甲酸水溶液-乙腈作為流動相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)選用0.01%甲酸水溶液-甲醇、0.01%甲酸水溶液-乙腈作為流動相時，目標(biāo)化合物離子化效果都較好，響應(yīng)信號都較強(qiáng)。鑒于甲醇價格較乙腈更便宜，故最終選擇0.01%甲酸水溶液甲醇作為流動相[13 - 14]。20種化合物的MRM總離子流色譜圖見圖1。

圖1 20種化合物在MRM模式下的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of a standard solution of 20 compounds in MRM mode

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧離子源正負(fù)離子模式下，先對各農(nóng)藥目標(biāo)物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，獲得穩(wěn)定的母離子，選擇離子監(jiān)測模式優(yōu)化碎裂電壓；再進(jìn)行子離子掃描，每個目標(biāo)物選取2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量、定性離子對，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量。由于麥草畏、4-氯苯氧乙酸、2甲4氯、2,4-滴丙酸、2甲4氯丙酸、2,4,5-涕、2,4-滴丁酸、2甲4氯丁酸、2,4,5-涕丙酸、三氯吡氧乙酸等農(nóng)藥的二級碎片離子除了[M-RCOOH]-響應(yīng)都偏低，故選氯的同位素準(zhǔn)分子離子[M+2-H]-和[M+2-RCOOH]-作為另外一對監(jiān)測離子對[15 - 16]。優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇考察的20種酸性除草劑大多在堿性條件下易離解成鹽而溶于水相中，故可向樣品中加入適量的酸來抑制其解離，從而增強(qiáng)酸性農(nóng)藥在有機(jī)相中的分配比例。分別用0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈、2.0%甲酸乙腈、純乙腈作為提取溶劑，樣品基質(zhì)為上海青，添加水平為0.200 mg/kg，其他條件如1.2。考察甲酸濃度對20種酸性除草劑回收率的影響，結(jié)果見圖2。純乙腈、2.0%甲酸乙腈回收率都偏低，而0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈都具有良好的提取效果，回收率都在滿意的范圍。本實驗采用0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑[17]。

*quantitative ion.

2.3.2 提取鹽包的選擇由于考察的20種酸性除草劑在水中的溶解度較大，除去更多的水可提高其在有機(jī)相中的分配比例。但除去過多的水會導(dǎo)致乙腈提取雜質(zhì)過多，影響后續(xù)凈化效果。本實驗考察了兩種鹽包：(1)4.0 g MgSO4+1.0 g NaCl；(2)6.0 g MgSO4+1.0 g NaCl，樣品基質(zhì)為上海青，添加水平為0.200 mg/kg，其他條件如1.2。20種酸性除草劑的回收率見圖3。方案(1)回收率范圍為79.9%～107%，方案(2)回收率范圍為69.5%～112%，故選用4.0 g MgSO4+1.0 g NaCl作為提取鹽包[18]。

圖2 乙腈中不同甲酸含量對回收率的影響Fig.2 Effects of different contents of formic acid in acetonitrile on recovery

圖3 鹽包中MgSO4不同含量對回收率的影響Fig.3 Effects of different contents of MgSO4 on recovery

圖4 不同吸附劑配比對回收率的影響Fig.4 Effects of different adsorbents on recovery

2.3.3 分散固相萃取吸附劑的選擇本方法采用分散固相萃取(dSPE)凈化，將固相吸附劑直接加入樣品提取液以吸附干擾物。常用的吸附劑有PSA、GCB、C18等。PSA去除糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性物質(zhì)。C18去除維生素、色素、甾醇等非極性物質(zhì)。GCB去除色素能力最強(qiáng)，但由于其表面的正六元環(huán)結(jié)構(gòu)會吸附一些平面及對稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥[19 - 20]。實驗考察了3種吸附劑配方：(1)50 mg GCB+900 mg MgSO4；(2)100 mg GCB+900 mg MgSO4；(3)50 mg GCB+900 mg MgSO4+150 mg PSA，樣品基質(zhì)為上海青，添加水平為0.200 mg/kg，其他條件如1.2。20種酸性除草劑的回收率見圖4。結(jié)果表明，方案(1)和(2)的回收率接近，GCB的增加沒有降低回收率，說明GCB對本實驗考察的20種除草劑吸附不強(qiáng)。50 mg GCB已可以凈化色素含量較少的大部分蔬菜，如凈化顏色較深的上海青、菠菜等色素多的蔬菜，也可以選擇50 mg或者100 mg GCB。方案(3)和(1)相比，二氯吡啶酸、氯氟吡氧乙酸、二氯喹啉酸等回收率降低較多，其他除草劑回收率也整體降低。說明PSA明顯吸附了考察的酸性除草劑。最終本實驗不采用PSA，采用50 mg GCB+900 mg MgSO4吸附劑。

3 分析方法的評價

3.1 線性范圍與定量限

配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行檢驗。以MRM定量離子的色譜峰面積(y)對分析物質(zhì)量濃度(x，mg/L)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，溴苯腈在0.005～0.20 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其余19種酸性農(nóng)藥在0.005～0.50 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.9939～0.9998之間，結(jié)果見表2。

同時取經(jīng)檢測不含待測目標(biāo)農(nóng)藥化合物的上海青空白基質(zhì)進(jìn)行定量限的考察，以≥10倍信噪比(S/N)確定定量限(LOQ)，20種化合物的定量限均不高于0.05 mg/kg，能夠滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留的測定要求。

3.2 準(zhǔn)確度與精密度

以黃瓜、番茄、豇豆、蘿卜、芹菜為樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實驗。基于基質(zhì)效應(yīng)，采用空白基質(zhì)提取液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。結(jié)果表明，3個添加水平回收率范圍為70.3%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于8.3%，見表3。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析要求。

表2 20種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和測定低限(上海青基質(zhì))(n=6)

表3 5種基質(zhì)中20種農(nóng)藥回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

(續(xù)表3)

CompoundSpiked levels(mg/kg)CucumberTomatoCowpeaTurnipCeleryRecovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Recovery(%) RSD(%)Bromoxynil1080.36.278.55.380.25.178.22.080.42.25082.05.281.22.880.55.381.51.380.54.310082.51.483.21.582.62.582.82.584.23.72,4-D1077.32.177.22.080.92.582.02.580.92.25082.24.081.61.582.52.081.61.382.21.010082.61.782.52.685.91.582.91.783.81.8MCPA1096.21.397.61.997.53.496.55.597.24.15096.91.498.81.598.54.9102 3.5102 3.5100102 2.8100 2.6105 3.4106 0.6104 0.22,4-DP10104 7.698.67.0101 6.5101 7.6100 3.650102 5.6101 3.2100 4.8102 2.9105 1.8100106 3.2107 4.2105 5.7106 3.5105 2.0MCPP1089.64.690.21.789.12.987.54.592.62.95093.61.895.72.594.02.589.23.293.71.310095.11.996.31.895.72.794.82.195.72.7Triclopyr1095.32.395.13.593.02.592.74.189.84.35097.51.096.21.595.82.197.51.596.21.610098.61.897.52.493.82.996.92.598.11.12,4,5-T5090.51.390.13.389.24.392.01.090.12.610095.60.996.22.095.12.695.11.895.04.620097.81.896.72.196.91.495.82.796.11.12,4-DB1082.35.781.02.881.93.380.66.281.55.35085.64.986.51.584.72.187.42.486.22.010088.52.589.23.787.24.589.42.586.81.5MCPB1090.24.387.23.292.12.091.63.890.02.05092.62.892.02.894.11.592.11.395.21.710095.72.596.02.095.21.195.22.497.10.92,4,5-TP1090.35.390.36.491.72.592.14.189.53.55092.52.792.42.594.23.693.82.894.02.010096.21.595.41.296.12.595.72.196.72.5

3.3 實際樣品檢測

應(yīng)用本實驗方法對在市場采購的上海青、黃瓜、番茄、豆芽、韭菜、蘿卜、花椰菜、洋蔥等蔬菜樣品進(jìn)行檢測，分別在兩批次上海青中檢測出氟吡禾靈，檢測值分別為0.012 mg/kg和0.015 mg/kg；一批次上海青中檢測出喹禾靈，檢測值為0.020 mg/kg；一批次韭菜中檢測出氯氟吡氧乙酸，檢測值小于0.050 mg/kg；五批次豆芽中檢測出4-氯苯氧乙酸，檢測值分別為0.210 mg/kg,0.124 mg/kg,0.234 mg/kg,0.083 mg/kg,0.158 mg/kg。

4 結(jié)論

本研究建立了同時測定蔬菜中20種酸性除草劑殘留的LC-MS/MS檢測方法。實驗對提取溶劑、鹽包、吸附劑、色譜條件和質(zhì)譜條件分別進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法操作簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確性強(qiáng)，滿足各種蔬菜基質(zhì)的日常檢測。