趙晶晶，莊寶祥，李如江*

（1濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濰坊261053）

石蠟切片是組織學(xué)常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的方法，經(jīng)取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、貼片和烤片等一系列步驟而成[1,2]。因小鼠胰腺為非實(shí)體器官，外分泌部腺泡呈散在分布，故其石蠟切片常常碎裂不完整，組織褶皺，免疫組織化學(xué)染色時(shí)易脫片，嚴(yán)重影響后續(xù)研究；筆者在以1型糖尿病小鼠進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，胰腺組織免疫熒光染色易致假陽性結(jié)果。對(duì)此，筆者通過系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，探索1型糖尿病小鼠胰腺石蠟切片及其免疫熒光染色的優(yōu)化策略，以制備優(yōu)質(zhì)的石蠟切片和規(guī)避免疫熒光假陽性染色，以期為后續(xù)胰腺相關(guān)研究提供技術(shù)保障。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自濟(jì)南動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

鼠抗高血糖素抗體（BOSTER）、兔抗高血糖素抗體（BOSTER）、FITC-山羊抗兔二抗（ZSGBBIO）、FITC-山羊抗小鼠二抗（ZSGB-BIO）。石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)（LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)）、攤烤片機(jī)（科迪KD-T電腦生物組織攤烤片機(jī)）。

3 模型制作和取材固定

鏈脲佐菌素 40mg/（kg·d）連續(xù)5d腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠1型糖尿病。頸椎脫臼處死，取胰腺，于濾紙上堆積成型，浸于4%多聚甲醛固定48h。

4 脫水、透明、浸蠟和包埋

脫水：將固定的胰腺梯度酒精脫水，依次為70%乙醇30 min、80%乙醇20 min、95%乙醇5/10/15/20 min×2次、100%乙醇4/6/8/10 min×2次，即95%、100%乙醇脫水分別嘗試4個(gè)不同的時(shí)間。

透明：分別選用二甲苯、氯仿、苯3種透明試劑，各嘗試3個(gè)時(shí)間段。苯10/15/20 min×2次，或氯仿10/15/20 min×2次，或二甲苯透明時(shí)間為6/8/10 min×2次。

浸蠟：浸蠟時(shí)僅一次硬蠟，65℃，分別浸蠟60、90、120 min。

包埋：石蠟包埋，凝固備用。

5 切片與免疫熒光染色

切片后進(jìn)行如下常規(guī)處理：47℃攤片、貼片后61℃烤箱1 h、37℃烤箱1周。

常規(guī)免疫熒光染色[3]，其中一抗為小鼠抗高血糖素抗體（1:100）、兔抗高血糖素抗體（1:100），二抗為FITC-山羊抗小鼠抗體（1:100）、FITC-山羊抗兔抗體（1:100）。

結(jié) 果

1 脫水時(shí)程過短或過長(zhǎng)均致組織碎裂

95%、100%乙醇脫水，時(shí)間過短致透明不全，時(shí)間過長(zhǎng)致組織變脆，過短、過長(zhǎng)皆導(dǎo)致切片時(shí)組織碎裂不能成型。如95%乙醇5/10min×2次、100%乙醇4min×2次時(shí)小鼠胰腺透明不全；95%乙醇20min×2次、100%乙醇10min×2次時(shí)小鼠胰腺組織脆，難以切片成型。

2 苯的透明效果較好

二甲苯透明速度快，但8/10min×2次時(shí)已使胰腺組織變脆，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量；氯仿、苯透明速度較二甲苯慢，但15/20min×2次時(shí)已完全透明，且組織脆性尚可，切片成型、皺褶較少，不過氯仿透明的石蠟切片顯微鏡下可見許多蜂窩狀空洞（圖1A）。

表1 不同時(shí)間對(duì)小鼠胰腺石蠟切片質(zhì)量的影響Tab. 1 The effect of different time on the quality of paraf fin sections of pancreas from mice

3 石蠟切片的綜合時(shí)程效果

95%乙醇15min×2次、100%乙醇6min×2次、苯15min×2次、浸蠟90min后石蠟包埋，切片時(shí)未出現(xiàn)組織過脆、破碎等現(xiàn)象，其切片質(zhì)量較好、組織完整、皺褶較少，鏡下胰腺結(jié)構(gòu)清晰（表1，圖1A）。

為進(jìn)一步優(yōu)化切片質(zhì)量，在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)各時(shí)間稍作微調(diào)，其結(jié)果顯示95%乙醇15min×2次、100%乙醇Ⅰ6min、100%乙醇Ⅱ7min、苯Ⅰ15min、苯Ⅱ18min、浸蠟90min時(shí)其切片質(zhì)量最優(yōu)（表1）。

4 小鼠源抗體免疫染色1型糖尿病小鼠胰腺時(shí)易出現(xiàn)假陽性熒光

1型糖尿病小鼠胰腺石蠟包埋時(shí)以氯仿透明，致使胰腺組織內(nèi)出現(xiàn)許多空洞（圖1A）。以小鼠抗高血糖素抗體或PBS代替一抗+FITC-山羊抗小鼠抗體進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)，胰島周圍或胰腺淋巴組織內(nèi)易出現(xiàn)假陽性的熒光染色（圖1B、1C）；以兔抗高血糖素抗體進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)胰島呈陽性反應(yīng)（圖1A），但鑒于1型糖尿病胰島常有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，為除外上述淋巴細(xì)胞假陽性染色的可能，以兔抗高血糖素抗體行胰腺（含淋巴組織）免疫熒光染色，胰腺淋巴組織內(nèi)未見陽性熒光（圖1D）。

圖1 1型糖尿病小鼠胰腺高血糖素免疫熒光染色。A，石蠟包埋時(shí)以氯仿透明，致使胰腺組織內(nèi)出現(xiàn)許多空洞（一抗為兔抗高血糖素抗體）；B，胰島周圍或胰腺淋巴組織內(nèi)的假陽性染色（箭頭）：無一抗（以PBS替代），二抗為FITC-山羊抗小鼠抗體；C，胰島周圍或胰腺淋巴組織內(nèi)的假陽性染色（箭頭）：一抗為小鼠抗高血糖抗體；D，無假陽性染色：一抗為兔抗高血糖素抗體；標(biāo)尺，20μmFig. 1 Immuno fluorescent staining for glucagon in the pancreas from type 1 diabetic mice. A, transparency by chloroform during paraf fin embedding caused many cavities in the pancreatic tissue, rabbit anti-glucagon antibody as primay antibody; B, false-positive immuno fluorescent staining around pancreatic islets or inside pancreatic lymphoid tissue (arrows): without primay antibody (replaced by PBS), FITC-conjugated goat-anti-mouse antibody as secondary antibody; C, false-positive immuno fluorescent staining around pancreatic islets or inside pancreatic lymphoid tissue (arrows); mouse anti-glucagon antibody as first antibody; D, no false-positive immuno fluorescent staining; rabbit anti-glucagon antibody as first antibody; scale bar, 20μm

討 論

脫水，即用脫水劑除去組織水分，并使組織進(jìn)一步固化，為后續(xù)透明及浸蠟創(chuàng)造條件[3]。脫水不足，影響透明浸蠟效果；脫水過度，組織易脆，切片時(shí)組織難以成型，易碎裂。高濃度乙醇脫水效果強(qiáng)，但需嚴(yán)格控制時(shí)間，故本實(shí)驗(yàn)探索了95%、100%乙醇脫水時(shí)間，尤其是100%乙醇脫水，以免脫水過度。諸多文獻(xiàn)表明[4,5]，動(dòng)物器官（切成0.5×0.5×0.5 cm3左右）石蠟包埋時(shí)，95%乙醇、100%乙醇梯度脫水分別超過1h、甚至3h以上。本實(shí)驗(yàn)中小鼠胰腺為非實(shí)體性器官，其梯度乙醇脫水時(shí)間與前述文獻(xiàn)不同，室溫下95%乙醇15 min×2次、100%乙醇Ⅰ6 min、100%乙醇Ⅱ7 min時(shí)效果最佳。

苯、二甲苯以及氯仿等因混溶于乙醇及石蠟，故可應(yīng)用于組織浸蠟前的透明。研究發(fā)現(xiàn)，透明可導(dǎo)致組織收縮、變硬、變脆，故須嚴(yán)格控制透明時(shí)間[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：二甲苯透明速度快，但8/10 min×2次時(shí)已使胰腺組織變脆，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量。故二甲苯透明作用雖強(qiáng)，但胰腺透明時(shí)不易控制時(shí)間，極易透明過度。已有實(shí)驗(yàn)表明：苯在透明心、肝、肺和腦等器官（厚約0.3 cm）時(shí)，透明時(shí)間可達(dá)8 h左右，且透明效果好[7]，故本實(shí)驗(yàn)為更好把控透明時(shí)間，選用了苯或氯仿作為透明試劑，發(fā)現(xiàn)兩者透明效果較為緩和，時(shí)間可控，又能明顯減輕組織過脆的現(xiàn)象，但氯仿?lián)]發(fā)性較強(qiáng)，透明組織內(nèi)氯仿易揮發(fā)，致使組織浸蠟常常不充分，其切片染色后呈現(xiàn)諸多空洞。綜上，胰腺組織透明時(shí)應(yīng)將苯作為首選透明劑。

浸蠟是使石蠟逐漸置換透明劑，以達(dá)到支持組織的目的。浸蠟進(jìn)一步提高了組織的硬度和脆性，同時(shí)浸蠟時(shí)間不足，組織內(nèi)可留有孔洞，無法切出完整切片，故浸蠟時(shí)間仍需探索。本實(shí)驗(yàn)中浸蠟時(shí)間1.5h為最優(yōu)，以避免浸蠟不足，切片不完整，或浸蠟過度，組織過度收縮、變硬和變脆。

以1型糖尿病小鼠胰腺進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用小鼠抗高血糖素抗體進(jìn)行免疫熒光染色時(shí)在胰島周圍或胰腺淋巴組織內(nèi)呈現(xiàn)明顯的免疫熒光染色，為求進(jìn)一步確認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)又以兔抗高血糖素抗體進(jìn)行免疫熒光染色，并未呈現(xiàn)前者的熒光，同時(shí)又以PBS替代一抗進(jìn)行免疫染色時(shí)，也呈現(xiàn)了如小鼠抗高血糖素抗體免疫熒光染色時(shí)相似的染色結(jié)果，故推測(cè)在胰島周圍或胰腺淋巴組織內(nèi)的陽性熒光染色為假陽性熒光染色。

胰島炎癥，即胰島周圍和內(nèi)部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，為1型糖尿病病理標(biāo)志。1型糖尿病小鼠胰腺組織中單核巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、部分T細(xì)胞等可含IgG[8]，本實(shí)驗(yàn)中FITC-山羊抗小鼠二抗便可與之特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性染色。所以，1型糖尿病或胰腺炎時(shí)，為避免胰腺免疫組化染色的假陽性，應(yīng)盡量避免選擇同種動(dòng)物源的一抗等，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中常規(guī)做陽性、陰性對(duì)照，以明確陽性結(jié)果。