謝彩霞，汪志文，魯義善，湯菊芬，簡(jiǎn)紀(jì)常

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

羅非魚(yú)（Oreochromis）是全世界廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，有生長(zhǎng)快、食性雜、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。我國(guó)是羅非魚(yú)生產(chǎn)大國(guó)，但隨著羅非魚(yú)種質(zhì)退化及養(yǎng)殖環(huán)境污染，各種疾病暴發(fā)，特別是無(wú)乳鏈球菌病，對(duì)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成較大影響[1-2]。無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）感染羅非魚(yú)后最明顯癥狀是，部分病魚(yú)眼球突出、周?chē)溲?，鰓蓋內(nèi)側(cè)發(fā)紅、充血或出血，病魚(yú)死亡率高達(dá)25%～80%[3-7]。

免疫機(jī)制研究已成為魚(yú)類(lèi)疾病預(yù)防的熱點(diǎn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)極其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）為該信號(hào)通路上主要調(diào)節(jié)蛋白，參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。IA 類(lèi)PI3K 是一種專(zhuān)性異二聚體，由一個(gè)催化亞基（p110）和調(diào)節(jié)亞基（p85）組成[8]，其中p110 由pik3ca基因編碼，p85 由pik3r1基因編碼。pik3r1是磷酸肌醇信號(hào)通路的重要調(diào)控基因，在哺乳動(dòng)物中已證實(shí)參與多種免疫途徑，目前對(duì)該基因的研究報(bào)道主要是在人的癌癥[9-11]、腫瘤[12-13]、胰島素調(diào)控[14]等方面，但在水產(chǎn)方面鮮有報(bào)道。筆者從尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）脾臟組織中克隆得pik3r1基因，研究該基因在健康及經(jīng)無(wú)乳鏈球菌刺激的羅非魚(yú)中的表達(dá)情況，為pik3r1在羅非魚(yú)鏈球菌病防控方面研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用尼羅羅非魚(yú) [(100 ± 10)g]購(gòu)自湛江市東風(fēng)市場(chǎng)，在（28±2）℃條件下暫養(yǎng)4 周后備用；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和無(wú)乳鏈球菌（S.agalctiaeZQ0910）菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；克隆載體pMD18-T Vector、Ex Taq 酶購(gòu)自TaKaRa 公司（大連）；引物由廣州生工合成，DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自ThermoFish 公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚(yú)總RNA 提取和cDNA 合成 取健康尼羅羅非魚(yú)脾臟組織10～ 20 mg，按照上海生工UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取羅非魚(yú)脾臟的總RNA；按照TaKaRa 公司的Reverse Transcriptase M-MLV 說(shuō)明書(shū)將提取到的羅非魚(yú)脾臟組織的總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA 第一鏈用于后續(xù)試驗(yàn)。無(wú)乳鏈球菌誘導(dǎo)試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸的無(wú)乳鏈球菌（1×107CFU/mL）0.1 mL，空白對(duì)照組注射滅菌的0.1 mL PBS，然后在4、8、12、24、48、72、96 h 取羅非魚(yú)頭腎、肌肉、脾臟、鰓、皮膚、腸道、腦、胸腺等8 個(gè)組織約10～ 20 mg，同法進(jìn)行羅非魚(yú)總RNA 提取和cDNA 合成。

1.2.2 羅非魚(yú)pik3r1 基因的分子克隆 依pik3r1基因編碼區(qū)利用 PrimerPremier 5.0 設(shè)計(jì)引物On-pik3r1-1F、On-pik3r1-2190R（表1），然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 10 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，目的條帶經(jīng)切膠回收后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E.coil）DH5α 中，最后進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送廣州生工測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 羅非魚(yú)pik3r1基因的生物信息學(xué)分析 用SeqMan 軟件對(duì)陽(yáng)性克隆的送測(cè)結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得On-pik3r1 編碼序列。分別用ExPASy(http://expasy.org/tools/)，InterProScan 程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）進(jìn)行蛋白質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用UCSC 預(yù)測(cè)內(nèi)含子外顯子；蛋白質(zhì)二級(jí)，三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)網(wǎng)址分別為PORTER (http://www.distill.ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/inter active)。Clutalx 和Genedoc 程序被用于氨基酸同源序列比對(duì)。通過(guò)MEGA6.0 軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 用qRT-PCR 分析pik3r1的組織表達(dá) 熒光定量特異性引物 q R T-P I K 3 R 1-1 3 0 4 F、qRT-PIK3R1-1514R 見(jiàn)表1，以β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔，使用熒光定量PCR儀對(duì)健康魚(yú)組織及經(jīng)無(wú)乳鏈球菌感染后的組織分別進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件參考TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒：預(yù)變性94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算On-pik3r1在健康魚(yú)及經(jīng)無(wú)乳鏈球菌感染后組織中的相對(duì)表達(dá)量，并使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 On-pik3r1 克隆結(jié)果及序列分析

On-pik3r1編碼區(qū)長(zhǎng)2 190 bp，編碼729 個(gè)氨基酸（圖1），理論分子質(zhì)量為83.99 ku，5′端UTR 為542 bp，3′端UTR 為2 248 bp，理論等電點(diǎn)為5.73，分子式為C3728H5839N1029O1136S23；脂肪系數(shù)為80.26，不穩(wěn)定指數(shù)為50.56，歸類(lèi)為1 個(gè)不穩(wěn)定蛋白；該蛋白總平均親水值為-0.689；ProtScale 分析（圖2）表明，On-pik3r1 蛋白親水性氨基酸含量較高，親水區(qū)域較大，為親水性蛋白，與理化分析結(jié)果一致，因此推測(cè)On-pik3r1基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白。Signal P 4.1 Server 預(yù)測(cè)該序列不存在信號(hào)肽；TMHMM Server 2.0 預(yù)測(cè)該蛋白為胞外蛋白，不存在跨膜區(qū)。對(duì)On-pik3r1的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)。ProtParam 在線(xiàn)分析顯示，On-pik3r1 推導(dǎo)的氨基酸序列中亮氨酸 (Leu) 含量最高，為10.2%；谷氨酸(Glu) 含量次之，為8.6%，色氨酸 (Trp) 含量最低，為1.2%。帶正電荷氨基酸 (Arg+Lys) 95 個(gè)，帶負(fù)電荷氨基酸 (Asp+Glu) 110 個(gè)。SoftBerry-Psite 預(yù)測(cè)該序列功能位點(diǎn)（圖1），發(fā)現(xiàn)該序列N-糖基化位點(diǎn)6個(gè)，酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)15 個(gè)，酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)1 個(gè)，蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)13 個(gè)，酰胺化化位點(diǎn)3 個(gè)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)3 個(gè)，戊基結(jié)合位點(diǎn)3 個(gè)，C-末端定位信號(hào)序列微體10個(gè)。InterProScan程序預(yù)測(cè)pik3r1結(jié)構(gòu)域由SH2、SH3 和RhoGAP 組成（圖3）。UCSC 預(yù)測(cè)的內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)如圖4。

圖1 尼羅羅非魚(yú)pik3r1 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame and deduced amino acid sequences of pik3r1 gene in Nile tilapia

圖1 續(xù)（Continued）

圖2 pik3r1 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted hydrophobicity of pik3r1 protein

圖3 pik3r1 功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 pik3r1 functional domain prediction

圖4 pik3r1 基因內(nèi)含子-外顯子基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Intron-exon gene structure of pik3r1 gene

2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

On-pik3r1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）中，α 螺旋含量為45.95%，β 折疊3.98%，無(wú)規(guī)則卷曲39.92%，延伸鏈為10.15%。On-pik3r1 三維結(jié)構(gòu)如圖6 所示。

圖5 尼羅羅非魚(yú)pik3r1 蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure prediction domains of pik3r1 protein in Nile tilapia

圖6 羅非魚(yú)與人類(lèi)pik3r1 蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Three-dimensional structures of pik3r1 in Nile tilapia and Homo sapiens

2.3 羅非魚(yú)On-pik3r1 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將pik3r1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)（圖7），發(fā)現(xiàn)pik3r1較保守，與其他物種的同源性在70%以上，其中與斑馬擬麗魚(yú)（Maylandia zebra）相似性最高，為98.53%，與虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、電鰻（Electrophorus electricus）、歐加里托幾維鳥(niǎo)（Apteryx rowi）的相似性分別為87.96%、84.14%、79.38%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，羅非魚(yú)和同斑馬擬麗魚(yú)聚為一支，親緣關(guān)系最為相近（圖8）。

圖7 羅非魚(yú)pik3r1 與其他物種pik3r1 氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Multiple alignment of the predicted On-pik3r1 with amino acid sequences in other species

圖8 鄰接法構(gòu)建pik3r1 氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of pik3r1 by neighbour-joining method

2.4 On-pik3r1 的組織表達(dá)分析

熒光定量結(jié)果顯示，On-pik3r1基因在所有組織中均可表達(dá)，且在肌肉中表達(dá)量最高，其次是鰓、皮膚，在胸腺中表達(dá)量最低（圖9）。在滅活無(wú)乳鏈球菌刺激羅非魚(yú)后，在不同時(shí)間點(diǎn)，On-pik3r1基因表達(dá)量在鰓、脾臟、頭腎、腸道、腦部等5 個(gè)組織中的表達(dá)均極顯著下調(diào)，在胸腺中表現(xiàn)為4 h 時(shí)極顯著下調(diào)，24、48、72 h 時(shí)為顯著下調(diào)（圖10）。

圖9 羅非魚(yú)pik3r1 在不同組織中的表達(dá)情況Fig.9 Expression of pik3r1 of Tilapia in different tissues

圖10 無(wú)乳鏈球菌感染后羅非魚(yú)pik3r1 在各個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)Fig.10 Temporal expression of pik3r1 in different tissues after infected by S.agalactiae

3 討論

本研究克隆鑒定得pik3r1（命名為On-pik3r1），On-pik3r1基因編碼區(qū)為2 190 bp，5′ UTR 為542 bp，3′ UTR 為2 248 bp。進(jìn)化樹(shù)中與斑馬擬麗魚(yú)親緣關(guān)系較近。在推導(dǎo)的On-pik3r1 序列中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SH2 結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH3 結(jié)構(gòu)域和RhoGAP 結(jié)構(gòu)域，這些保守區(qū)域與其他物種序列較一致。經(jīng)比對(duì)，pik3r1 氨基酸序列在魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中高度保守，這些結(jié)果表明，pik3r1 在這些物種中可能有類(lèi)似的功能。

本研究中，On-pik3r1在健康尼羅羅非魚(yú)各組織中均有表達(dá)，但不同組織間表達(dá)量差異較大，肌肉最高，鰓、皮膚次之，胸腺最低，pik3r1在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[15]的脾臟、肝臟、心臟、腸、腦、皮膚、腎臟、一側(cè)性腺、肌肉、鰓絲10 種組織中亦均有表達(dá)，且不同組織間表達(dá)量差異較大，說(shuō)明pik3r1基因參與魚(yú)類(lèi)的多種生理反應(yīng)。胸腺是T 細(xì)胞成熟分化的場(chǎng)所，PI3K 信號(hào)可通過(guò)激活PKB、Rac 等信號(hào)途徑而參與T細(xì)胞的活化、分化[16]，PI3K 的激活主要依賴(lài)于p110 的活性，但p85 對(duì)p110 有抑制作用[17]，pik3r1表達(dá)量低，則p85對(duì)p110的抑制作用降低，有利于p110參與PI3K的激活，從而激活PKB、Rac 等信號(hào)途徑而參與T細(xì)胞的活化、分化。本研究中，On-pik3r1在羅非魚(yú)胸腺表達(dá)量低，表明pik3r1參與羅非魚(yú)T細(xì)胞的活化、分化，在羅非魚(yú)免疫調(diào)節(jié)中有重要作用。

經(jīng)滅活無(wú)乳鏈球菌刺激后，On-pik3r1的表達(dá)量在鰓、腸道、脾臟、頭腎、腦部等5 個(gè)組織中均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)，在胸腺中4 h 時(shí)極顯著下調(diào)，24、48、72 h 時(shí)為顯著下調(diào)，這可能與pik3r1的調(diào)控模式有關(guān)：pik3r1表達(dá)的下調(diào)激活了PI3K 信號(hào)通路，使炎癥的發(fā)生成為可能[18-19]，pik3r1可能對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)揮抑制作用。已在患有肝細(xì)胞癌的小鼠中驗(yàn)證pik3r1的這種調(diào)控模式[20]，但在其他動(dòng)物上并未得到證實(shí)。無(wú)乳鏈球菌在體內(nèi)大量繁殖時(shí)會(huì)引起急性炎癥反應(yīng)。無(wú)乳鏈球菌侵染魚(yú)體時(shí)，最先是巨噬細(xì)胞首先對(duì)無(wú)乳鏈球菌吞噬作用，但當(dāng)無(wú)乳鏈球菌繁殖速度比巨噬細(xì)胞吞噬速度快得多時(shí)，巨噬細(xì)胞中pik3r1的下調(diào)會(huì)損傷應(yīng)答脂多糖（LPS）的NO和白介素（IL-12）的產(chǎn)生，使胞內(nèi)易受細(xì)菌感染[21]，巨噬細(xì)胞會(huì)攜帶著無(wú)乳鏈球菌突破血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[22]，病原菌因而可逃避魚(yú)體免疫系統(tǒng)的清除作用，使鏈球菌更易擴(kuò)散至其他器官和組織，引起多器官功能障礙和細(xì)菌性敗血癥，最后導(dǎo)致魚(yú)體死亡。因此，pik3r1的下調(diào)表達(dá)可能可作為魚(yú)體發(fā)生無(wú)乳鏈球菌病的有效征兆，通過(guò)進(jìn)一步研究，pik3r1可能會(huì)給無(wú)乳鏈球菌病的治療提供新靶點(diǎn)。