孫茹茹 姜霽珊 徐葉 黃志雄 秦智

摘? 要： 氫能因具備高熱值、燃燒產物無污染、原料來源廣泛等優(yōu)點成為最具潛力的新能源之一。暗發(fā)酵因不受光照限制，產氫能力強，并可以解決環(huán)境污染問題而成為研究的熱點。該文主要綜述了暗發(fā)酵制氫的代謝途徑及其研究進展，重點闡述了產氫菌株關鍵酶或基因改造的最新研究成果，并對其未來的應用進行了展望。

關鍵詞： 微生物制氫; 暗發(fā)酵; 產氫途徑; 菌株改造

中圖分類號： Q 939.9? ? 文獻標志碼： A? ? 文章編號： 1000-5137（2020）06-0614-08

Abstract： Hydrogen energy has become the most potential new energy source because of its high calorific value，non-polluting combustion products and wide sources of raw materials.Dark fermentation has become a research hotspot because it is not restricted by light，has strong hydrogen production capacity and can also solve some environmental pollution problems.In order to understand the dark fermentation process in depth，this paper mainly reviewed the metabolic pathways and key enzymes of dark fermentation for hydrogen production，and summarized the advances on the modification of key enzymes from hydrogen-producing strains.The prospects of their future application were given as well.

Key words： microbial hydrogen production; dark fermentation; hydrogen production pathway; strain modification

0? 引? 言

目前，全球約87%的能源消耗是通過煤炭、石油、天然氣等化石能源燃燒獲得的[1]。隨著社會的發(fā)展，人們對能源的需求越來越高，化石能源因其不可再生性而迅速減少[2]。此外，化石能源燃燒所帶來的環(huán)境污染問題，如CO2的釋放造成的溫室效應等日趨嚴重，開發(fā)新的可再生綠色能源迫在眉睫[3]。氫能具有清潔、能量密度高、零排放、可再生等優(yōu)點，被視為最具發(fā)展?jié)摿Φ奈磥砟茉粗籟4]。目前，制備氫氣主要采用化石燃料高溫裂解和水電解兩種方法[5-6]。這兩種制氫方法不僅需要消耗化石能源，轉化率低，還會污染環(huán)境[7]，從經濟和環(huán)保等方面考慮，都不適合于氫能源的產業(yè)化。

利用某些微生物新陳代謝過程產生氫氣的制氫方法稱作生物制氫，生物制氫過程大多在環(huán)境溫度和壓力下運行，能耗較低。同時，生物制氫還可以利用高濃度有機廢水、工農業(yè)廢棄物，以及市政垃圾等為原料，有利于廢物回收利用，對環(huán)境友好，為利用可再生能源開辟了一條新的途徑[8]。生物制氫技術主要包括藻類和藍細菌生物法光解水產氫、光合細菌產氫，以及厭氧細菌暗發(fā)酵產氫3種途徑[9-11]。微藻、藍細菌和光合細菌產氫都需要在光照條件下進行，與暗發(fā)酵相比產氫速度較慢，效率較低。暗發(fā)酵過程是在沒有光照的情況下，通過厭氧微生物將有機化合物轉化為生物氫，同時生成各種有機酸或醇類副產物。厭氧微生物可能是兼性或專性的。能夠進行暗發(fā)酵產氫的微生物有許多，主要包括：梭菌屬（Clostridium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、埃希氏菌屬（Escherichia）、丁酸芽孢桿菌屬（Trdiumbutyricum）、檸檬酸細菌屬（Citrobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、醋微菌屬（Acetomicrobium）、甲烷球菌屬（Methanococcus）等[12]。暗發(fā)酵生物制氫基質來源廣泛、底物轉化率高、能量利用率高、產氫能力強、不需要光照，因此是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镏茪浞绞街弧?/p>

1? 暗發(fā)酵制氫及制氫機理

GRAY等[13]最先開展了微生物厭氧產氫途徑的理論研究。1965年，他們提出了丙酮酸脫羧產氫途徑，分為梭桿芽孢桿菌型和腸道桿菌型。2000年，TANISHO[14]提出了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氫離子（H+）氧化還原產氫途徑，通過NADH的再氧化產氫（圖1）。

1.1 丙酮酸途徑產氫

丙酮酸產氫途徑在梭菌屬和古細菌中最常見。1 mol的葡萄糖經糖酵解產生2 mol的丙酮酸，在丙酮酸脫氫酶的作用下，丙酮酸的羰基先被輔酶焦磷酸硫胺素（TPP）進攻，形成丙酮酸與TPP的加成化合物。繼而，丙酮酸-TPP加成物脫羧形成羥乙基硫胺素焦磷酸，并將電子傳遞給鐵氧還蛋白（Fd），F(xiàn)d再將電子傳遞給氫化酶，最終在氫化酶的作用下，H+獲得電子，形成H2，如圖1（b）所示。在此途徑的基礎上，AKHTAR等[15]發(fā)現(xiàn)氫化酶、Fd和氧化還原酶等都含有Fe-S簇，負責合成Fe-S簇的基因過量表達可提高菌株的產氫能力。

在兼性厭氧菌（如大腸桿菌）中最常見的途徑是由丙酮酸-甲酸裂解酶（PFL）和甲酸氫裂解酶（FHL）兩種酶催化，如圖1（c）所示。丙酮酸在PFL的催化下形成乙酰CoA和甲酸，此后，在FHL的作用下甲酸裂解產生CO2和H2[16-17]，總體反應如下：

C6H12O6+2H2O→4H2+2CO2。

1.2 NADH+H+平衡調節(jié)產氫

NADH/NAD+輔因子在微生物分解代謝中起主要作用，在有氧條件下，O2將作為最終的電子受體。在厭氧條件下，NAD+的再生是通過NADH還原代謝中間物來實現(xiàn)的[18]。在微生物厭氧發(fā)酵產氫體系中，葡萄糖在生成丙酮酸（圖1（a））的同時產生大量的NADH和H+。丙酮酸在不同酶的催化下發(fā)生不同的代謝途徑，其產物包括乙酸、乙醇、丁酸，以及乳酸等。在此過程中，NADH和H+被氧化成NAD+，從而調節(jié)微生物代謝過程中NADH和NAD+的平衡[19]。但是，當NADH+H+氧化過程慢于NADH+H+的形成過程時，NADH+H+就會不斷積累，NADH通過氫化酶的作用將電子轉移給H+，從而釋放H2 （NADH+H+→NAD++H2）。

細菌細胞內NADH和NAD+的平衡過程和發(fā)酵產物酸性末端數(shù)量是影響發(fā)酵類型的主要因素[20]。根據(jù)發(fā)酵液相末端產物的組成，可以將厭氧產氫的發(fā)酵類型分為丁酸型、丙酸型，以及乙醇型發(fā)酵。

1.2.1 丁酸型發(fā)酵

當?shù)孜镆云咸烟?、蔗糖、淀粉、乳糖等可溶性碳水化合物為基質時，大多會呈現(xiàn)丁酸型發(fā)酵。丁酸型發(fā)酵的主要末端產物是乙酸、丁酸、CO2和H2。丁酸型發(fā)酵的優(yōu)勢種群是梭狀芽孢桿菌（Clostridium），主要包括丁酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium butyricum）和酪丁酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium tyrobutyricum）[21]。其中，在丁酸梭狀芽胞桿菌的發(fā)酵途徑中，乙酰CoA經一系列的酶催化可產生丁酸、丁醇和乙酸，乙酸又可以和丁酰CoA反應，生成丁酸和乙酰CoA，如圖1（d）所示。其中3-羥基丁酰CoA脫氫酶和丁酰CoA脫氫酶是關鍵的產氫酶，可將NADH催化為NAD+，從而產生H2。

1.2.2 丙酸型發(fā)酵

在厭氧發(fā)酵過程中，當基質中的含氮有機物（如肉膏、明膠、酵母膏）或者纖維素等難降解的碳水化合物含量較高時，發(fā)酵類型主要表現(xiàn)為丙酸型。丙酸型發(fā)酵的主要特征是不產生氣體或產生氣體很少，丙酸為主要的液端發(fā)酵產物，伴有乙酸、琥珀酸、CO2等副產物生成，如圖1（e）所示。丙酸發(fā)酵主要是丙酸桿菌屬（Propionibacteria）[22]。研究發(fā)現(xiàn)，丙酸產量較高的菌株主要集中在丙酸桿菌屬中的幾個種，如特氏丙酸桿菌（Propionibacteria thoenii）、費氏丙酸桿菌（Propionibacteria freudenreichii）、薛氏丙酸桿菌（Propionibacteria shermanii）和產酸丙酸桿菌（Propionibacteria acidipropionici）等[23]。

1.2.3 乙醇型發(fā)酵

經典的乙醇發(fā)酵代謝途徑是指經糖酵解途徑（EMP），酵母菌屬降解碳水化合物形成丙酮酸，再經一系列酶催化形成乙醇，末端發(fā)酵產物只有乙醇和CO2。REN等[24]對厭氧發(fā)酵反應器的優(yōu)勢菌群進行研究時發(fā)現(xiàn)：經厭氧訓化后，污泥中的優(yōu)勢菌群為梭狀桿菌屬（Clostridium）和擬桿菌屬（Bacteroides），并沒有觀察到酵母菌（Saccharomyces）;同時，在產生的氣體中檢測出大量氫氣，液相末端的主要發(fā)酵產物為乙醇和乙酸，如圖1（f）所示，因此，他們將這種產氫途徑命名為乙醇型發(fā)酵。乙醇型發(fā)酵的優(yōu)勢細菌為產乙醇桿菌屬（Ethanoligenens），如哈爾濱產乙醇桿菌（Ethanoligenens harbinense）[25]。乙醇型發(fā)酵的關鍵酶為乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶。

2? 暗發(fā)酵產氫菌株改造

暗發(fā)酵制氫存在非常大的優(yōu)勢，圍繞暗發(fā)酵制氫已經做了很多方面的研究。大多是從接種物[26]、反應底物[26-27]、反應器類型[27-28]、金屬離子[28]、溫度[29]和pH值[29]等方面進行研究和報道的。發(fā)酵產氫菌株是制氫的核心，近年來，研究人員開始利用分子生物學方法開展氫酶，以及其他產氫相關酶的分子遺傳學研究，為揭示產氫機理提供了重要信息[30]。

2.1 利用基因敲除提高菌株產氫量

暗發(fā)酵微生物將碳分解代謝中的電子導入氫離子來合成H2。該產氫途徑的關鍵酶主要包括氫化酶、Fd和氧化還原酶等，這些都常含有Fe-S簇。例如，在梭狀芽孢桿菌中，F(xiàn)e-Fe氫化酶，[4Fe-4S]-Fd和丙酮酸：Fd氧化還原酶催化丙酮酸依賴的H2合成，[4Fe-4S]-Fd和氧化還原酶都含有兩個Fe-S簇[31]。在細菌中，F(xiàn)e-S簇的組裝和合并由3個操縱子編碼的酶催化，它們是NIF（固氮）、SUF（硫利用因子）和ISC（Fe-S簇）。在這3種酶中，由ISC操縱子編碼的酶在大腸桿菌的正常生長條件下，起到Fe-S輔因子組裝和插入的作用。IscR的缺失會導致ISC操縱子的過度表達，然而ISC的過度表達可能增強了暗發(fā)酵菌類合成Fe-S簇的能力。AKHTAR等[15]研究了IscR缺失對重組梭狀芽胞桿菌[FeFe]氫酶的活性，和對大腸桿菌BL21產氫的能力影響。結果表明，在厭氧條件下，IscR缺失可將合成[FeFe]氫酶的酶活性提高3倍，IscR的缺失能促進重組的梭狀芽孢桿菌中[4Fe-4S]-Fd的合成;在缺氧條件下，IscR的缺失還增強了特異性、總的氫化酶的積累和其活性。因此，IscR缺失是刺激產氫的有效策略。

梭菌產酸階段或指數(shù)增長階段產生氫氣、乙酸、丁酸和二氧化碳。理論上，當發(fā)酵末端產物為乙酸時，每摩爾葡萄糖可得到4 mol H2。當最終發(fā)酵產物為丁酸時，每摩爾葡萄糖可得到2 mol H2[32]。丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum）是發(fā)酵產氫的常用微生物之一。在產生氫氣的同時，可以產生酸（乳酸、乙酸和丁酸）、二氧化碳，以及少量的乙醇。HALLENBECK[33]認為丁酸鹽形成途徑是制氫過程中的主要競爭途徑，因為它比其他途徑消耗更多的NADH，從而降低了氫氣的產量，除此之外末端產物丁酸鹽還會抑制微生物的生長。因此，消除丁酸途徑可以提高梭狀芽孢桿菌的產氫能力。由丁酸型發(fā)酵途徑可知3-羥基丁酰CoA脫氫酶是丁酸生成途徑中第一個氧化NADH的酶。CAI等[34]通過與大腸桿菌的種間結合，將質粒（pMTL007）轉移至丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum），并敲除該菌中編碼3-羥基丁酰CoA脫氫酶基因HBD。結果表明：丁酸梭狀芽胞桿菌中HBD的缺失導致丁酸途徑失活，與野生型菌株相比，乳酸、乙酸產量增加，而H2產量明顯下降，并產生大量乙醇。敲除HBD基因的菌株產氫量急劇下降，因此可以通過工藝優(yōu)化來提高產氫量。生物反應器液相和頂空的氫分壓是影響產氫能力的關鍵因素之一，因此采用N2噴射來降低H2分壓。優(yōu)化后的工藝表明：在低的H2分壓下，缺乏HBD菌株的H2產量增加，乙醇產量下降，這表明抑制丁酸梭狀芽胞桿菌（C.butyricum）的丁酸途徑對其自身的生長并無影響，其H2產量可能與乙醇途徑競爭NADH。

2.2 利用蛋白工程提高產氫量

在厭氧發(fā)酵產氫微生物中，[FeFe]氫酶催化質子接受電子產生氫氣，是產氫代謝途徑中的關鍵步驟，其活性直接影響著微生物的產氫效率[35]。然而該酶對氧的高敏感性一直是厭氧發(fā)酵制氫技術實施的主要障礙之一。[FeFe]氫酶中含有574個氨基酸殘基和5個Fe-S簇。有文獻報道，蛋氨酸氧化會影響蛋白質的功能特性[36-37]。KOO等[38]通過氨基酸殘基突變提高了氫化酶對O2的耐受性。將蛋氨酸替換為亮氨酸，因為它們具有相似的疏水性和相同大小的官能團，并且能將對蛋白質折疊的影響降到最低。結果表明：突變后的[FeFe]氫酶對O2的忍耐性提高了2倍以上。雖然產氫量與對照組相比并無明顯上升，但是為產氫酶的研究提供了一種新思路。

2.3 構建高效產氫菌株

依賴丙酮酸的氫氣合成是暗發(fā)酵產氫微生物最重要的產氫途徑。與NAD（P）H依賴的H2途徑相比，丙酮酸途徑H2合成受最終產物抑制的影響要小很多。大腸桿菌BL21（DE3）中ydbK的缺失會導致H2的積累顯著減少;IscR是負責編碼ISC操縱子的負轉錄調節(jié)因子，IscR的缺失有利于氫化酶和[4Fe-4S]-Fd的合成、積累和活性的增強。KALIM等[15]構建了一個高產的合成物，質粒pA攜帶一個合成操縱子，編碼Fe-Fe氫化酶HydA及其所需的成熟因子HydF，HydE和HydG。質粒pAF含有一個額外的基因，編碼巴斯德尿桿菌（CpFdx）的[4Fe-4S]-Fd（CpFdx）。大腸桿菌YdbK與HydA，HydA成熟因子（HydE，HydF和HydG）共同表達，在密閉血清瓶中培養(yǎng)17～24 h，與不表達重組YdbK或CpFdx的菌株相比，YdbK和CpFdx共表達的菌株產氫量提高了9倍以上。在IscR缺失的菌株中H2的積累進一步增強。

3? 結論與展望

與其他生物制氫途徑相比，暗發(fā)酵制氫具有產氫能力高、產氫速率快、產氫持續(xù)穩(wěn)定、反應裝置簡單、操作方便、原料來源廣泛等優(yōu)點，容易實現(xiàn)規(guī)?；a。目前，暗發(fā)酵產氫研究大多處于實驗室規(guī)模的分批、半連續(xù)或連續(xù)過程，還沒有大規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模的暗發(fā)酵制氫研究的報道。主要原因是：在利用純菌種為主的生物制氫方法中，純菌種分離增加了成本;并且純菌多為嚴格厭氧菌，工業(yè)規(guī)?；瘯共僮髯兊美щy;小型實驗易取得高產氫率，但較難達到長期運行并持續(xù)產氫的效果。目前正在研發(fā)將混合菌發(fā)酵、暗發(fā)酵和其他產氫途徑相耦合的運行機制。

參與暗發(fā)酵的微生物有兼性和專性厭氧菌、純菌（分離菌株）、混合菌（來自厭氧消化污泥、堆肥土壤等）、嗜熱和中溫微生物。與混合菌發(fā)酵相比，使用純菌發(fā)酵的主要優(yōu)勢是生產率更高，但是存在污染、保存過程中代謝途徑改變和突變等問題?；旌暇l(fā)酵可以降低大規(guī)模工業(yè)生產過程中的操作難度，可以積極地利用各種有機物，直接利用廢水，并且能夠適應更大范圍的工藝參數(shù)（有機物負荷、pH值和溫度）。因此，混合菌發(fā)酵不需要介質滅菌，工藝成本低，更適合大規(guī)模應用。厭氧消化污泥、土壤和屠宰場污泥的混合培養(yǎng)物都是工業(yè)廢水生物制氫的有利來源[25]。

在暗發(fā)酵過程中，厭氧細菌將食品或農業(yè)廢物，或者農業(yè)、造紙或制糖業(yè)的廢水中的復雜碳化合物分解為簡單的有機酸（乙酸、丙酸和丁酸等可揮發(fā)脂肪酸），導致pH值降低，抑制厭氧細菌生長和產氫。然而，這些揮發(fā)性脂肪酸可以被微藻類用作底物，用于生產化學藥品和能源。黑暗發(fā)酵產生的代謝物可以被藻類利用，藻類又可以作為額外的生物量再次進行發(fā)酵過程。微藻培養(yǎng)主要利用葡萄糖和果糖等單糖，這使得藻類制氫過程成本高昂，工業(yè)化吸引力降低。利用暗發(fā)酵后富含有機酸的廢水作為微藻培養(yǎng)基，可以降低有機酸積累對暗發(fā)酵制氫的抑制，同時降低微藻培養(yǎng)成本，可謂一舉兩得[39]。

今后暗發(fā)酵制氫的研究重點主要為：利用現(xiàn)代分子生物學技術研究發(fā)酵產氫途徑，利用生物工程技術選育高效產氫菌株，發(fā)展混合微生物菌群有機廢水發(fā)酵的規(guī)?；a，探索不同菌種間的相互作用，深入推進聯(lián)合生物制氫研究。

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（責任編輯：馮珍珍，顧浩然）