韓云軒 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

昆蟲每年危害作物會(huì)造成數(shù)十億美元的損失，而使用化學(xué)殺蟲劑會(huì)產(chǎn)生抗性和對(duì)非靶標(biāo)的不利影響。尋找對(duì)靶標(biāo)更高選擇性的害物管理工具是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者、政府機(jī)構(gòu)和研究人員的重中之重的任務(wù)。RNA干擾(RNAi)是正在出現(xiàn)的很有希望替代化學(xué)殺蟲劑的技術(shù)。RNAi能使昆蟲體內(nèi)重要基因沉默，選擇性殺死靶標(biāo)害蟲。昆蟲攝入雙鏈RNAs (dsRNA)后RNAi效應(yīng)啟動(dòng)。dsRNA被攝食后，必須從腸腔運(yùn)輸?shù)侥c上皮細(xì)胞的胞液中。上皮細(xì)胞的吸收是RNAi效應(yīng)啟動(dòng)所必須的，RNAi沉默過(guò)程主要通過(guò)2步實(shí)現(xiàn)，第一步：Dicer酶(核酸酶的核糖核酸酶III家族的成員)把 dsRNA 加工為 20～25 bp的小干擾RNA (short interfering RNA，siRNA)；之后，siRNA被納入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)中，在此siRNA被解開為2條單鏈：“導(dǎo)向”鏈(guide strand)和“隨從”鏈(passenger strand)。隨從鏈被從復(fù)合體中除去，導(dǎo)向鏈指導(dǎo)RISC復(fù)合體與互補(bǔ)的 mRNA相互作用，抑制此靶標(biāo)mRNA的翻譯。Argonaute-2蛋白是RISC的一部分，在識(shí)別和降解mRNA中具有重要作用，其含有2個(gè)域：PAZ和PIWI。PAZ域具有捕獲靶標(biāo)mRNA模板的導(dǎo)向鏈。PIWI域?qū)⒉东@的mRNA切割成2個(gè)片段，并被胞質(zhì)核酸酶進(jìn)一步降解。然而，RNAi途徑也具有內(nèi)源性調(diào)節(jié)基因表達(dá)以及針對(duì)病毒和轉(zhuǎn)座子的免疫應(yīng)答的功能。圖1說(shuō)明了不同siRNA途徑之間的基本差異。

除了經(jīng)口攝入外，dsRNA也能通過(guò)浸澤或微注射進(jìn)入昆蟲血淋巴中。微注射能繞開腸道，誘導(dǎo)系統(tǒng)反應(yīng)。目前有數(shù)種微注射技術(shù)，但大部分費(fèi)時(shí)，使用的設(shè)備有內(nèi)部生產(chǎn)的到精密的微處理器控制的注射器。因此微注射法不是實(shí)際可用于害物防治的方法，但可用于研究?jī)?yōu)異的dsRNA候選物。局部處理(topical administration )被定義為通過(guò)外骨骼直接進(jìn)行dsRNA給藥?？蓪?duì)整個(gè)昆蟲進(jìn)行均勻的dsRNA噴霧或腹側(cè)微量應(yīng)用。相對(duì)于注射，這種方法節(jié)省勞力和能夠高通量篩選基因。然而，只有一些發(fā)表的文章表明用此方法的前景。其中一個(gè)研究為用以柑橘木虱(Diaphorina citri)成蟲的5個(gè)細(xì)胞色素P450基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA溶液處理柑橘木虱的胸部。用dsRNA處理成蟲的死亡率顯著高于未處理。也介紹了用相似的方法以熒光 dsRNA局部處理玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼蟲，結(jié)果表明dsRNA能滲透昆蟲體壁，在體腔中循環(huán)。

有人提出局部應(yīng)用dsRNA后，dsRNA可能通過(guò)節(jié)間膜，特別是在腹側(cè)(腹板)，通過(guò)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)板之間的膜和附肢基部的腔(足和翅膀)和通過(guò)每側(cè)(胸膜)外側(cè)部，包括氣門被昆蟲吸收。雖然如此，但還需要進(jìn)一步研究闡明局部應(yīng)用后 dsRNA進(jìn)入的確切機(jī)制。也探索了用dsRNA溶液浸澤昆蟲的方法。對(duì)黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)幼蟲的處理表明在浸澤過(guò)程中果蠅攝入溶解于浸澤溶液中的dsRNA分子。在這個(gè)研究中，在含有以葡萄糖醛酸糖苷酶轉(zhuǎn)錄物為靶標(biāo)的dsRNA混合物中加入食用色素。酶的活性降低50%，在腸中發(fā)現(xiàn)了食用色素。此方法好像在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用比在田間更適合。

毫無(wú)疑問攝入 dsRNA是有最大潛力進(jìn)行害物管理的 dsRNA給藥途徑，而且多年來(lái)一直這樣認(rèn)為。此方法具有防治害蟲的潛力具有數(shù)種原因：⑴基因沉默發(fā)展抗性風(fēng)險(xiǎn)中等；⑵ dsRNA在不影響非靶標(biāo)物種的情況下，以非常高的準(zhǔn)確度作用于適宜的轉(zhuǎn)錄物；⑶ dsRNA可被制備為可噴霧使用的制劑，能夠大面積使用，因此昆蟲取食后選擇性地作用于靶標(biāo)昆蟲；⑷ dsRNA對(duì)刺吸式和咀嚼式口器昆蟲有效。然而，dsRNA過(guò)早降解(攝入前)，在昆蟲腸道內(nèi)的降解，物種間 RNAi效應(yīng)的變異性，腸道上皮細(xì)胞的吸收不良以及 dsRNA擴(kuò)增的缺乏是目前限制該害物管理方法的一些障礙。本文介紹了已開發(fā)的用來(lái)克服這些問題的方法，包括使用納米技術(shù)工具。納米技術(shù)是涉及納米級(jí)材料的有前途的跨學(xué)科領(lǐng)域。數(shù)種類型的納米材料，特別是納米粒子已用于提高dsRNA的經(jīng)口傳遞能力。納米粒子能與dsRNA相互作用，保護(hù)dsRNA免于被核酸酶和其他環(huán)境條件過(guò)早地降解。此外，納米粒子能夠在腸上皮細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)傳遞dsRNA。這篇綜述也介紹了昆蟲腸道的特性對(duì) dsRNA傳遞的總效率的影響。最后，討論了dsRNA的特異性、所需劑量、目標(biāo)選擇和其他參數(shù)，這些參數(shù)可能在該技術(shù)在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用中起重要作用。

圖1 昆蟲中3個(gè)RNA干擾途徑的示意圖：外源性siRNA(exo-siRNA)、內(nèi)源性siRNA (endo-siRNA)和microRNA(miRNA)途徑

1 腸道內(nèi)的dsRNA

dsRNA經(jīng)口后直接進(jìn)入昆蟲腸道。昆蟲腸道分為3個(gè)部分：前腸、中腸和后腸。在腸道的3個(gè)區(qū)域中，中腸具有大的表面積和結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)吸收營(yíng)養(yǎng)。中腸由3種類型的上皮細(xì)胞組成：具有專門用于吸收營(yíng)養(yǎng)的微絨毛的柱狀細(xì)胞(腸上皮細(xì)胞)、內(nèi)分泌細(xì)胞和干細(xì)胞。大概是在這些細(xì)胞中dsRNA被吸收和加工。腸上皮細(xì)胞通過(guò) 2種途徑內(nèi)化來(lái)自腸腔的dsRNA：⑴ 跨膜通道蛋白介導(dǎo)的吸收途徑；⑵ 內(nèi)吞途徑。報(bào)道昆蟲存在這2種系統(tǒng)，很可能二者也涉及從腸道吸收dsRNA，然后到達(dá)血淋巴。然而，仍然沒有有關(guān)dsRNA在昆蟲體內(nèi)運(yùn)輸?shù)男畔?，以及哪個(gè)系統(tǒng)涉入此過(guò)程(圖2)。關(guān)于內(nèi)吞途徑，昆蟲中最有據(jù)可查的為網(wǎng)格蛋白依賴型途徑。數(shù)種離體和活體研究表明藥物抑制腸上皮細(xì)胞中此途徑會(huì)導(dǎo)致dsRNA吸收的降低，主要發(fā)生在馬鈴薯甲蟲等鞘翅目昆蟲中。另一常見的內(nèi)吞途徑——吞噬作用主要發(fā)現(xiàn)在特定血細(xì)胞，例如漿血細(xì)胞。模式識(shí)別受體(PRRs)和清道夫受體在吞噬作用吸收dsRNA中對(duì)識(shí)別dsRNA具有重要作用。抑制黑腹果蠅體內(nèi)清道夫受體(SR-Cl)導(dǎo)致dsRNA內(nèi)化下降90%以上。關(guān)于跨膜蛋白通道介導(dǎo)的吸收，在馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、玉米根葉甲(Diabrotica virgifera)、歐洲蜜蜂(Apis mellifera)和褐飛虱(Nilaparvata lugens)等一些昆蟲中確定了sid-1-like(系統(tǒng)干擾缺陷)或Sil蛋白家族。這些受體好像涉入dsRNA的內(nèi)化，因?yàn)榛蚯贸龑?dǎo)致RNAi效應(yīng)下降。這已在玉米根葉甲、褐飛虱和馬鈴薯甲蟲中發(fā)現(xiàn)。研究表明在歐洲蜜蜂取食dsRNA后，其sid-1-like基因的表達(dá)水平增加。然而，這些跨膜蛋白在dsRNA吸收中確切作用仍在調(diào)查中。赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、家蠶(Bombyx mori)、東亞飛蝗(Locusta migratoria)和沙漠蝗蟲(Schistocerca gregaria)等品種具有sid-1-like基因，但在敲除基因后，RNAi效應(yīng)僅僅部分受影響或根本不受影響。為了解釋此種情況，提出內(nèi)吞作用和sid-1-like蛋白可能同時(shí)起作用，雖然只在線蟲中證實(shí)此種協(xié)同作用。另一方面需要調(diào)查的是是否dsRNA施用方法影響吸收途徑。中腸的吸收途徑可能與血腔周圍組織中的不同。

1.1 圍食膜基質(zhì)

昆蟲圍食膜基質(zhì)(PM)包裹攝入的食物，保護(hù)昆蟲免受微生物侵染和機(jī)械化損傷。其也是滅活攝入毒素的生化障礙。主要由甲殼素和糖蛋白組成的圍食膜能阻止dsRNA有效地傳遞到腸上皮細(xì)胞(圖2)。圍食膜內(nèi)膜中的帶負(fù)電荷的蛋白多糖和膜孔大小不利于dsRNA傳遞。出現(xiàn)在圍食膜中的帶負(fù)電荷的蛋白多糖阻礙dsRNA自由運(yùn)輸通過(guò)圍食膜。這層蛋白多糖對(duì)dsRNA的帶負(fù)電荷的磷酸骨架產(chǎn)生排斥力。用陽(yáng)離子納米粒子屏蔽帶負(fù)電的 dsRNA可以增強(qiáng)dsRNA通過(guò)PM的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明用含有dsRNA的核殼型熒光納米顆粒(FNP-dsRNA)飼喂黑腹果蠅幼蟲，F(xiàn)NP-dsRNA比單獨(dú)的dsRNA(naked dsRNA)能更有效地穿過(guò)PM。關(guān)于PM孔的大小，因昆蟲種類的不同而不同，PM中的孔或通道的大小為7～36 nm。這些孔可能是暫時(shí)的，并可能根據(jù)所攝入的食物而改變，潛在地影響dsRNA通過(guò)PM。蚊子在吸血后，PM的孔隙度增加，近而胞吐作用分泌的消化酶能從上皮細(xì)胞遷移。然而，文獻(xiàn)表明沒有試驗(yàn)證明 PM孔的大小是如何影響dsRNA的運(yùn)輸?？偟膩?lái)說(shuō)，在dsRNA進(jìn)入腸道后PM的確切作用仍知道的很少。需要進(jìn)行更多研究來(lái)了解dsRNA和PM的相互作用特點(diǎn)。

圖2 提出的柱狀細(xì)胞從腸腔吸收dsRNA的2種途徑：跨膜通道介導(dǎo)的吸收途徑(左)和內(nèi)吞途徑(右)

1.2 消化核酸酶

昆蟲腸道含有參與消化攝入物質(zhì)的不同類型的酶。核酸是數(shù)種昆蟲品種的一部分天然食物，因此核酸酶(例如 DNases和 RNases)在消化中具有重要作用。不同昆蟲品種的腸中核酸酶的濃度和家族不同，這可能取決于數(shù)個(gè)因素，其中包括取食習(xí)慣。因此，難以分類腸核酸酶和不同昆蟲品種的核酸酶活性。對(duì)4種昆蟲[斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、亞洲飛蝗(L. migratoria)、美洲大蠊(Periplaneta americana)和Zophobas atratus]體內(nèi)降解dsRNA核酸酶的比較研究表明這些品種的大部分dsRNA酶嗜堿性，最適宜的pH約9。此外，它們的活性很大程度上取決于最佳的鎂離子濃度。最近報(bào)道亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)(鱗翅目)中名為 up54基因好像響應(yīng)于dsRNA而上調(diào)了。對(duì)此基因的測(cè)序分析表明其編碼1個(gè)以前未被表征的核酸酶，在其他7種鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)了其同源序列。此核酸酶具有離體和活體消化單鏈RNA (ssRNA)、dsRNA和dsDNA的能力。此核酸酶被作者重新命名為蛋白R(shí)NAi效應(yīng)相關(guān)核酸酶(REase)。只在馬鈴薯甲蟲腸道中表達(dá)的2個(gè)核酸酶基因最近也被鑒定和表征：Ld_dsRNase1和Ld_dsRNase2。這些dsRNA酶的敲除增加了昆蟲對(duì)經(jīng)口 dsRNA的敏感性。也報(bào)道稻綠蝽(Nezara viridula)的轉(zhuǎn)錄物組含有腸道和唾液腺分泌的約134個(gè)核酸酶。這些研究表明昆蟲體內(nèi)含有豐富的核酸酶，它們具有廣泛的底物特異性及其高度進(jìn)化的生理學(xué)。

也有許多口外消化的昆蟲。這些昆蟲把唾液注射入食物或分泌到食物上使食物分解，然后取食。這在半翅目昆蟲中常見，一些咀嚼式口器的昆蟲在取食葉時(shí)會(huì)在葉上沉積大量唾液。用于口外消化的唾液核酸酶也能在dsRNA被取食前分解其。已從不同種類蠅的唾液中鑒定出品種特異性dsRNA酶：稻綠蝽中的類Rrp44蛋白、致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatus)的CuquEndo和舌蠅的Tsal蛋白1和2。目前，大多數(shù)dsRNA酶的特性仍未知。弄明白這些酶的結(jié)構(gòu)和作用是優(yōu)化 RNAi技術(shù)在田間應(yīng)用來(lái)防治害蟲需解決的重要問題。這將能夠開發(fā)有效避免dsRNA被核酸酶降解的dsRNA傳遞策略。

1.3 昆蟲腸道pH

不同品種昆蟲的血淋巴的 pH相對(duì)一致(pH 6.4～7.5)，但不同品種昆蟲腸道和腸道不同區(qū)域中pH變化大，雙翅目、直翅目和鱗翅目昆蟲腸道pH為堿性(9～10.5)，而一些半翅目和鞘翅目昆蟲腸道pH為中性到強(qiáng)酸性。RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了RNA在酸性條件下較穩(wěn)定。在堿性條件下(pH 9～10.5)，單鏈RNA(ssRNA)可經(jīng)2步反應(yīng)被水解，與2'-羥基發(fā)生酯交換反應(yīng)，同時(shí)裂解 RNA鏈，然后生成的2,3-磷酸二酯發(fā)生水解(圖3)。在DNA制備中通過(guò)堿水解去除RNA污染物。然而，與單鏈ssRNA相比，dsRNA的雙螺旋把其堿水解限制在一定程度。目前的文獻(xiàn)表明還沒有對(duì) dsRNA的堿水解進(jìn)行詳細(xì)的研究。對(duì)dsRNA的1或2條鏈進(jìn)行化學(xué)修飾或應(yīng)用納米顆粒技術(shù)提高 dsRNA的穩(wěn)定性和阻止dsRNA被堿水解。對(duì)dsRNA雙鏈的化學(xué)修飾可能有助于提高穩(wěn)定性。對(duì)核糖2'-羥基進(jìn)行修飾會(huì)避免此降解過(guò)程。報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 2'-羥基被 2'-甲氧基和2'-氟取代可極大地增加對(duì)核酸酶消化的抗性。數(shù)種核酸酶催化2'-羥基的親核攻擊和磷酸間鍵的水解。

1.4 影響腸道中dsRNA穩(wěn)定性的其他因素

目前，經(jīng)口攝入dsRNA的RNAi效應(yīng)在不同昆蟲目間差異很大。此外，對(duì)于一些品種，需要過(guò)量的dsRNA才能達(dá)到最小的效果。如前所述，dsRNA在堿性腸道中分解或被核酸酶過(guò)早降解可能是導(dǎo)致dsRNA低效的一個(gè)因素。發(fā)育階段也可能影響沉默率。卵、幼蟲和成蟲階段昆蟲體內(nèi)dsRNA酶水平和pH可能不同，攝入的dsRNA的消耗率也取決于發(fā)育階段。飼喂斑翅實(shí)蠅(Drosophila suzukii)成蟲和幼蟲 dsRNA，此 dsRNA的作用靶標(biāo)為液泡分揀蛋白SNF7、液泡H[+]ATP酶、核糖體蛋白S13和α-外被體蛋白轉(zhuǎn)錄物。成蟲和幼蟲的處理?xiàng)l件一樣，試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)成蟲的沉默效應(yīng)較低和死亡率低。研究了對(duì)蚜蟲(Myzus persicae)基因表達(dá)水平的影響，得到了相似的結(jié)果。經(jīng)口給予dsRNA(作用于電壓門控鈉通道)對(duì)第一和二齡幼蟲比對(duì)其他齡幼蟲有較高沉默效應(yīng)。相似地，對(duì)赤擬谷盜幼蟲和成蟲的研究表明幼蟲對(duì)經(jīng)口傳遞的 dsRNA-BiP和 dsRNA-Armet更敏感。食草性昆蟲的取食可能對(duì)dsRNA傳遞產(chǎn)生生態(tài)性而不是生理屏障。例如，前幾齡幼蟲要比后幾齡幼蟲消費(fèi)較少的食物。如果外用或以植物嵌入式殺蟲劑應(yīng)用，低齡蟲由于取食率低可能不會(huì)接受到致死劑量的dsRNA，就會(huì)取食更長(zhǎng)時(shí)間。此外，成蟲和同品種幼蟲可能具有不同的營(yíng)養(yǎng)需求和取食率。另一知之甚少的因素是昆蟲微生物群在dsRNA吸收中的潛在作用。腸道細(xì)菌影響腸道pH，也分泌降解dsRNA或干擾腸道細(xì)胞吸收dsRNA的核酸酶。因此，腸道環(huán)境是增加經(jīng)口攝入dsRNA的RNAi的轉(zhuǎn)錄物敲除率的重要因素。

2 經(jīng)口給予昆蟲dsRNA的策略和限制

2.1 通過(guò)食物給予合成的dsRNA

攝入dsRNA的RNAi可通過(guò)不同方法完成。最簡(jiǎn)單的方法給昆蟲飼喂含有合成dsRNA的食物。用滴管把 dsRNA溶液滴在或噴霧于葉和人工食物表面制取含有dsRNA的固體食物；把dsRNA以需要的濃度溶解于液體食物中。dsRNA可通過(guò)酶促逆轉(zhuǎn)錄或化學(xué)合成而離體合成。通過(guò)此方法已成功對(duì)數(shù)個(gè)品種進(jìn)行了基因沉默，其中一些昆蟲和靶標(biāo)基因列于表1。顯然，許多靶標(biāo)基因，如甲殼素合成酶、α-微管蛋白和液泡型H+-ATP酶等對(duì)昆蟲重要，壓制它們的翻譯可能導(dǎo)致昆蟲死亡。人們對(duì)此類靶標(biāo)有很大的興趣可能是由于此技術(shù)可被開發(fā)替代農(nóng)藥。RNAi策略也已被用于防治蜜蜂和蠶等的經(jīng)濟(jì)重要性病害。這些昆蟲通過(guò)產(chǎn)絲和蜂蜜以及給果樹授粉每年產(chǎn)生數(shù)億美元的產(chǎn)值。這類昆蟲被病毒和寄生蟲侵染會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如多種因素可引發(fā)蜂群崩潰綜合癥(CCD)，如以色列急性麻痹病毒(IAPV)的侵染、農(nóng)藥和生物多樣性的減少。把作用于IPAV基因的dsRNA噴霧施于蜂巢，被IPAV侵染的蜂群可65%恢復(fù)。相似地，一研究小組研究了商業(yè)化 dsRNA產(chǎn)品(RemebeeTM)防治越冬蜜蜂的IAPV的防效。Remebee?是2個(gè)480 bp dsRNA分子的混合物，專門針對(duì) IAPV設(shè)計(jì)，然而，還沒有弄清楚其確切的序列。用 Remebee?處理后，蜜蜂種群的產(chǎn)蜜量是未處理的3倍。用合成的dsRNA防治在植物內(nèi)部取食的昆蟲(吸食和內(nèi)食性)時(shí)在葉表面噴霧dsRNA溶液無(wú)效，需要其他施用策略。最近研究了通過(guò)土壤灌溉或枝干注射，維管系統(tǒng)傳遞dsRNA溶液來(lái)防治吸汁棕紋蝽(brown marmorated stink bug)。灌溉和枝干注射卵黃蛋白原-A1和保幼激素酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶 dsRNA，棕紋蝽的死亡率為35%～40%。相似地，把番茄根浸澤在魚尼汀受體(RyRs)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和煙堿乙酰膽堿α6(nAChRs)dsRNA溶液中，番茄斑潛蠅在植物葉片上取食后，其死亡率達(dá)到80%。從這些研究推斷出植物韌皮部系統(tǒng)能夠?qū)sRNA傳遞到植物所有組織，這對(duì)于控制以植物組織以及液汁為食的昆蟲有益。

一般，可接受的沉默效應(yīng)可以通過(guò)在昆蟲食物中摻入合成的dsRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些效應(yīng)在RNAi易感物種(例如鞘翅目)中更為明顯，其中沉默率約為100%。相比，耐RNAi品種，其基因被敲除率約為0-50%。出現(xiàn)這種情況最可能的原因?yàn)槟c道環(huán)境和結(jié)構(gòu)的不同。經(jīng)口攝入 dsRNA后，對(duì)敏感鞘翅目(赤擬谷盜)和耐性半翅目[豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)]中 RNAi效應(yīng)的系統(tǒng)比較證實(shí)這些結(jié)論。在此研究中，對(duì)2種昆蟲飼喂dsRNA，2種dsRNA長(zhǎng)度相同，分別影響V-型ATP酶亞單元E(VTE)和抑制細(xì)胞凋亡(IAP)基因，試驗(yàn)結(jié)果為赤擬谷盜攝入 VTE和IAP-dsRNA后，其死亡率為 100%。豌豆蚜攝入IAP-dsRNA死亡率達(dá)到65%。對(duì)于蚜蟲，盡管中腸pH為中性，但是較差的RNAi效應(yīng)可能是由于分泌的唾液導(dǎo)致dsRNA降解所致。蚜蟲和大多數(shù)吸汁式昆蟲與取食固體食物的昆蟲具有不同的腸道結(jié)構(gòu)。它們具有缺少圍食膜的濾室。其濾室旨在移動(dòng)大量液體，而不是像咀嚼昆蟲那樣減慢固體的處理速度?？梢哉f(shuō)，咀嚼式口器昆蟲與刺吸式昆蟲相比，其中腸吸收dsRNA的時(shí)間更長(zhǎng)。另一研究比較了siRNA片段和其前體全長(zhǎng) dsRNA的敲除效應(yīng)。給棉鈴蟲(Helicoverpa zea)和煙蚜夜蛾(Heliothis virescens)飼喂全長(zhǎng)激素生物合成激活神經(jīng)肽(PBAN)dsRNA，幼蟲生長(zhǎng)延遲，二者的死亡率為75%以上，而siRNA處理死亡率約為55%。因此，全長(zhǎng)dsRNA分子好像比siRNA片段能啟動(dòng)更強(qiáng)的RNAi效應(yīng)。許多研究發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，這可能是由于：⑴ 腸道細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)dsRNA的吸收比小的siRNA分子更有效；⑵ 有21 bp與mRNA互補(bǔ)的長(zhǎng)dsRNA分子比具有相同序列的21 bp的siRNA的RNAi效應(yīng)更高。

圖3 蛋白質(zhì)金屬核酸酶中一般金屬離子驅(qū)動(dòng)機(jī)制的例子

表1 攝入合成的dsRNA可以啟動(dòng)RNAi并靶向各種節(jié)肢動(dòng)物中的各種基因

續(xù)表

這些研究表明飼喂昆蟲含有合成 dsRNA的食物產(chǎn)生的 RNAi效應(yīng)可能受許多因素的影響：腸道核酸酶、腸道pH和dsRNA分子的長(zhǎng)度。此外，飼喂食物一般需要大量的dsRNA來(lái)激發(fā)RNAi效應(yīng)。有時(shí)，這些效應(yīng)變化大，即使是同一品種昆蟲。此外，在攝入前也會(huì)發(fā)生一定水平的降解，因?yàn)閐sRNA酶也可能存在于食物中。腸上皮細(xì)胞的吸收不足也可能弱化 RNAi效應(yīng)。大規(guī)模生產(chǎn)用于害物管理的dsRNA可能仍然不具有成本效益。此外，通過(guò)重組微生物或病毒傳遞 dsRNA對(duì)非靶標(biāo)生物有潛在的侵染風(fēng)險(xiǎn)，但此方法對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)和提取dsRNA有用?？傊?，簡(jiǎn)單地通過(guò)飼喂含有合成dsRNA的食物的基因沉默在目前好像是更適合實(shí)驗(yàn)室研究，而不是大田應(yīng)用。

2.2 合成dsRNA與納米粒子聯(lián)合應(yīng)用

納米粒子被定義為大小為1～100 nm的粒子，在科學(xué)文獻(xiàn)中此范圍比較大，一些文獻(xiàn)中納米粒子是指大小為1～500 nm的材料。納米粒子可能包含陽(yáng)離子聚合物、肽、糖、脂質(zhì)和金屬等不同分子，它們的應(yīng)用差異也很大。在經(jīng)口攝入dsRNA的RNAi過(guò)程中，納米粒子可作為分子載體，促進(jìn)dsRNA跨腸上皮細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。納米粒子還可以保護(hù)核酸免受腸道內(nèi)部核酸酶的降解。脂質(zhì)體、鳥苷酸聚合物、量子點(diǎn)、殼聚糖和支鏈兩親性多肽膠囊(BAPC)和核-殼納米粒子是已用于增加昆蟲取食dsRNA的RNAi效應(yīng)的納米粒子系統(tǒng)，表2列出了更多如此系統(tǒng)的例子。

納米粒子用于對(duì)經(jīng)口攝入dsRNA的RNAi有耐性的昆蟲后有明顯積極的作用。此情況為腸道環(huán)境堿性強(qiáng)的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)等許多鱗翅目昆蟲。以幾丁質(zhì)合成酶B的基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA和聚鳥苷酸納米粒子的聯(lián)合物可使害蟲死亡率增加53%，而單獨(dú)的dsRNA所致的死亡率只有16%。此外，用甜菜夜蛾腸液處理這些dsRNA-聚合物復(fù)合體，dsRNA能耐腸液的降解時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30 h。飼喂豌豆蚜dsRNA和BAPC納米粒子聯(lián)合物，BAPC是2個(gè)支鏈兩親性肽以等摩爾濃度混合自組裝而成的肽納米膠囊。攝入BAPC與BiP-dsRNA聯(lián)合物(t1/2=4～5 d)，與攝入相同量的 BiP-dsRNA(t1/2=11～12 d)相比蚜蟲死亡時(shí)間早。試驗(yàn)的BiP基因轉(zhuǎn)錄物是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的一部分，抑制其翻譯可導(dǎo)致昆蟲死亡。

值得一提的是，BAPC和含胍的聚合物納米粒子含有氨基，pKa為9～13。具有這些功能團(tuán)的納米粒子在中性和堿性腸道環(huán)境中更穩(wěn)定。對(duì)于 BAPC來(lái)說(shuō)，其賴氨酸的氨基會(huì)質(zhì)子化，使pH約10.5。去質(zhì)子化會(huì)改變氨基酸的凈電，使dsRNA-納米粒子復(fù)合物的穩(wěn)定性降低。一般，如果這些納米粒子的氨基周圍溶液的pH高于pKa，這些氨基就會(huì)去質(zhì)子化。

2.2.1 納米粒子和dsRNA締結(jié)過(guò)程

在大多數(shù)情況下，納米粒子和dsRNA通過(guò)靜電作用進(jìn)行締結(jié)。納米粒子中的陽(yáng)離子基團(tuán)(例如氨基)與dsRNA的磷酸基結(jié)合[圖4(A)和(G)]。其結(jié)果是形成不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的納米粒子-dsRNA復(fù)合體：球形、小泡狀、棒狀和多層。高分辨率掃描探針顯微鏡[例如原子力顯微鏡(AFM)]可以提供有關(guān) dsRNA-納米顆粒復(fù)合物的形狀、大小和高度的精確信息。圖4(B)和(E)是殼聚糖和BAPC納米粒子與dsRNA相互作用的AFM圖像，而圖4(C)和(D)是游離納米粒子的。一般，盡管與dsRNA帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)相互作用，但dsRNA復(fù)合物仍保留凈正電荷，這有助于與也帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面相互作用[圖4(A)和(G)]。

肝磷脂、皮膚素和軟骨素的硫酸化形式等天然黏多糖鏈?zhǔn)钦婧思?xì)胞膜具有負(fù)電位的原因。需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，來(lái)說(shuō)明 dsRNA復(fù)合物的幾何形狀、大小和電荷如何影響昆蟲中RNAi活性和生物分布。

圖4 用于誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)RNAi效應(yīng)的不同dsRNA-納米粒子復(fù)合體

2.3 細(xì)胞對(duì) dsRNA-納米粒子復(fù)合物的吸收和其在胞內(nèi)的消失

一旦dsRNA-納米粒子復(fù)合體結(jié)合于細(xì)胞膜上，它們最有可能通過(guò)內(nèi)吞作用在細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化。筆者認(rèn)為 dsRNA-納米粒子復(fù)合體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)的吸收過(guò)程仍不明了。只研究了裸露的dsRNA(沒有和納米粒子締結(jié))的細(xì)胞內(nèi)化過(guò)程。從對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的研究，筆者推斷這些復(fù)合物最可能通過(guò)內(nèi)吞作用被細(xì)胞吸收，也有一些聚合物通過(guò)細(xì)胞膜的直接遷移的非內(nèi)吞途徑內(nèi)化，隨后擴(kuò)散到細(xì)胞中(圖5)。

在細(xì)胞吸收dsRNA后，一般認(rèn)為中等程度的基因沉默效應(yīng)可能是由于內(nèi)吞小泡(初級(jí)內(nèi)體、次級(jí)內(nèi)體和溶酶體)的捕獲和隨后的降解所致。dsRNA與納米粒子的復(fù)合體有助于避免 dsRNA在這些囊泡中的降解。聚合物和肽納米粒子能夠通過(guò)稱為“海綿效應(yīng)”的過(guò)程逃脫初級(jí)和次級(jí)內(nèi)體的捕獲。由于細(xì)胞器的正常酸化作用，這些納米顆粒中存在的叔胺基團(tuán)在內(nèi)體內(nèi)被質(zhì)子化。此過(guò)程導(dǎo)致Cl-反離子流入以恢復(fù)中性。隨后，通過(guò)滲透，過(guò)量的水進(jìn)入內(nèi)體，導(dǎo)致膜破裂。然而，確切的機(jī)制將取決于納米粒子的類型，總的來(lái)說(shuō)，此過(guò)程仍有爭(zhēng)議。

2.3.1 RNAi技術(shù)中納米粒子的潛力和不足

dsRNA與納米粒子締合有助于克服昆蟲攝入dsRNA產(chǎn)生 RNAi效應(yīng)所遭遇的細(xì)胞外和細(xì)胞障礙。如前所述，dsRNA從昆蟲食物到腸道的上皮細(xì)胞這個(gè)過(guò)程中，dsRNA經(jīng)常暴露于降解源(例如核酸酶，堿性pH)和物理屏障(營(yíng)養(yǎng)膜)。納米粒子可保護(hù)dsRNA免受核酸酶和堿的水解。納米粒子也能使其穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，有助于逃脫內(nèi)體的捕獲。然而，需要更多的研究來(lái)了解納米粒子在整個(gè)經(jīng)口傳遞中的確切作用。只有1個(gè)試驗(yàn)研究了dsRNA締結(jié)和沒有締結(jié)納米粒子的情況下經(jīng)口使用后在赤擬谷盜內(nèi)臟器官中的分布。飼喂赤擬谷盜幼蟲熒光標(biāo)記的締結(jié)BAPC的dsRNA，結(jié)果在中腸上皮細(xì)胞、脂肪體和馬氏管中發(fā)現(xiàn)熒光，但只是在dsRNA締結(jié)BAPC的情況下。飼喂幼蟲dsRNA，在這些區(qū)域發(fā)現(xiàn)非常弱的熒光，或沒有熒光。值得一提的是，在脂肪體中也發(fā)現(xiàn)了dsRNA。此器官參與多個(gè)代謝途徑，雖然以前沒有報(bào)道經(jīng)取食后在此器官中的RNAi。另一受爭(zhēng)議的為在細(xì)胞中dsRNA與納米粒子的解離。為了能夠被Dicer加工，dsRNA需要不受納米粒子的束縛。對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究表明此解離過(guò)程發(fā)生于內(nèi)體釋放后。納米粒子不能夠與dsRNA解離會(huì)限制Dicer加工dsRNA的能力。因此，必須謹(jǐn)慎選擇dsRNA與納米粒子的比例。需要相似的優(yōu)化過(guò)程來(lái)發(fā)現(xiàn)適用于昆蟲的適宜比例。納米粒子另一潛在的缺點(diǎn)是大規(guī)模生產(chǎn)成本高。制備納米粒子所需的原材料價(jià)很高。最后，由于與核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的不良相互作用，具有陽(yáng)離子性質(zhì)的納米粒子可觸發(fā)細(xì)胞毒性。在植物中，納米粒子的毒性與質(zhì)外生生物質(zhì)流中的孔和障礙物的堵塞有關(guān)，從而減少了養(yǎng)分的吸收，干擾了光合作用，并破壞了DNA。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，脂質(zhì)體可啟動(dòng)免疫反應(yīng)，也抑制重要酶的活性，例如蛋白激酶。一些陽(yáng)離子聚合物可引起細(xì)胞膜不穩(wěn)定，引發(fā)質(zhì)外體途徑。總之，納米粒子在環(huán)境中的影響需要在安全用于作物前進(jìn)行仔細(xì)評(píng)估。

表2 用于防治害蟲的dsRNA/納米粒子的例子

圖5 腸上皮細(xì)胞可能通過(guò)2種途徑吸收dsRNA-納米粒子

2.4 轉(zhuǎn)基因植物

獲得RNAi效應(yīng)的另一常見方法是昆蟲取食轉(zhuǎn)基因植物。植物介導(dǎo)RNAi包括開發(fā)產(chǎn)生品種特異性的dsRNA轉(zhuǎn)基因植物。開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物的最常見策略之一為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens)。對(duì)于表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，首先將反向重復(fù)序列克隆到質(zhì)粒載體上，然后將其引入細(xì)菌根癌農(nóng)桿菌中。然后用根癌農(nóng)桿菌侵染靶標(biāo)植物，并將一部分質(zhì)粒載體整合到植物基因組中。許多研究用此方法開發(fā)了防治半翅目、鞘翅目和鱗翅目的dsRNA轉(zhuǎn)基因植物，已獲得成功的 RNAi效應(yīng)。然而，植物自己 RNAi機(jī)器(Dicers)把長(zhǎng)的 dsRNA加工為siRNA為開發(fā)dsRNA轉(zhuǎn)基因植物的主要障礙。在昆蟲吞噬前，長(zhǎng)dsRNA被加工為20～25 bp siRNA可顯著地降低 RNAi效應(yīng)。然而，此問題已通過(guò)在缺乏此機(jī)器的細(xì)胞器中表達(dá) dsRNA(例如葉綠體)而加以克服。例如飼喂馬鈴薯甲蟲以表達(dá)定殖于葉綠體、以肌動(dòng)蛋白為靶標(biāo)的 dsRNA，其死亡率 100%；而飼喂定殖于植物的原子核dsRNA，昆蟲沒有死亡。相似地，在煙草(Nicotiana benthamiana)的葉綠體中表達(dá)乙酰膽堿酯酶dsRNA，棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)幼蟲取食此煙草后死亡率達(dá)70%。然而，缺乏有效的再生方案和單子葉植物的耐受性特性限制了許多植物中葉綠體轉(zhuǎn)化的成功應(yīng)用。因此，核轉(zhuǎn)化仍是開發(fā)表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物的常用策略。與對(duì)照相比，表達(dá)抗18S核糖體RNA的dsRNA的核轉(zhuǎn)化大豆植物可致大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella)35%死亡，且對(duì)植物的傷害降低了。相似地，最近研究篩選了玉米根葉甲和油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)的50個(gè)基因，選擇了4個(gè)非常重要的靶標(biāo)基因。此外，開發(fā)了作用于選擇的 4個(gè)基因：Ras opposite (Rop)，DNA-directed RNA聚合酶II亞基(DNA-directed RNA polymerase II subunit，RpII140)、染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑(Dre4)和mRNA前體剪接因子(ncm)。飼喂試驗(yàn)中玉米根葉甲和油菜花露尾甲的死亡率為60%～80%。植物的韌皮部汁液富含氨基酸、糖和其他營(yíng)養(yǎng)成分，此類植物是取食韌皮部昆蟲喜歡危害的對(duì)象。表達(dá)抗羧肽酶(Nlcar)、類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶(Nltry)和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NIHT) 3個(gè)重要基因的dsRNA的轉(zhuǎn)基因水稻已被開發(fā)。飼喂褐飛虱這些植物，使基因轉(zhuǎn)錄水平降低40%～70%。該技術(shù)的潛在局限性是dsRNA在植物中的積累減少，這可以顯著降低劑量和沉默效應(yīng)的功效。

2.5 轉(zhuǎn)化的微生物和病毒

使用表達(dá) dsRNA的工程化微生物也是一個(gè)常見的經(jīng)口施用dsRNA的方法?？梢詫sRNA構(gòu)建體克隆到細(xì)菌/酵母質(zhì)粒中來(lái)大量生產(chǎn)。通常，轉(zhuǎn)化的微生物缺乏RNAaseIII編碼基因來(lái)避免dsRNA降解。dsRNA通過(guò)轉(zhuǎn)化的微生物傳遞具有成本效益，而且相對(duì)容易進(jìn)行。通過(guò)將dsRNA編碼質(zhì)?？寺〉郊?xì)菌中可以大量生產(chǎn)dsRNA。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒和細(xì)菌菌株必須缺少 RNase III編碼基因，以防止早期dsRNA降解。此外，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌與食物混合后經(jīng)口傳遞給昆蟲。攝入的細(xì)菌與其他腸道微生物競(jìng)爭(zhēng)定殖。此技術(shù)首先應(yīng)用于鱗翅目，飼喂表達(dá)幾丁質(zhì)合酶-A dsRNA的大腸桿菌(Escherichia coli )細(xì)胞于甜菜夜蛾幼蟲、蛹和成蟲。此研究也表明定殖的轉(zhuǎn)化細(xì)菌能在腸道中釋放 dsRNA，然后通過(guò)Sil-蛋白介導(dǎo)的途徑被腸上皮細(xì)胞吸收。已提出2個(gè)方法來(lái)從表達(dá)dsRNA細(xì)菌傳遞dsRNA到昆蟲：熱滅活細(xì)菌(heat-killed bacteria )和活體細(xì)菌。用表達(dá)幾丁質(zhì)酶的熱滅活轉(zhuǎn)基因大腸桿菌處理黏蟲(Mythimna separata)幼蟲，在取食5 d后死亡率約16%。然而，取食含有表達(dá)作用于2個(gè)微管蛋白基因的dsRNA的活大腸桿菌細(xì)胞的人工飼料，處理后5 d，40%幼蟲死亡，蛻皮受到抑制。這些結(jié)果表明活體細(xì)菌可能比熱滅活細(xì)菌更有能力保護(hù)dsRNA不被腸道核酸酶和pH降解，傳遞dsRNA于柱狀細(xì)胞。此外，另一研究發(fā)現(xiàn)，飼喂小菜蛾和棉鈴蟲幼蟲和成蟲表達(dá)dsRNA的活體細(xì)菌會(huì)嚴(yán)重影響幼蟲的蛻皮，死亡率高達(dá)50%。處理成蟲，對(duì)產(chǎn)卵和孵化的抑制率達(dá)到68%，但存活的卵孵化后沒有發(fā)現(xiàn)其基因轉(zhuǎn)錄受抑制，表明使用活細(xì)菌可能會(huì)影響昆蟲變態(tài)過(guò)程。另一方面，用表達(dá)β1整合蛋白dsRNA的活體和熱滅活轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細(xì)胞處理甜菜夜蛾，甜菜夜蛾的死亡率30%～35%，二者沒有差異。因此，用活體或滅活細(xì)菌所致的 RNAi的敏感性可能與品種有關(guān)，要考慮的1個(gè)因素是使用活體細(xì)菌進(jìn)行噴霧處理植物可能會(huì)引起一些安全隱患，而且監(jiān)管機(jī)構(gòu)很可能不會(huì)批準(zhǔn)這種方法。文獻(xiàn)報(bào)道的一些有關(guān)轉(zhuǎn)化微生物的研究已應(yīng)用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證，這些轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細(xì)胞不是昆蟲微生物菌群的一部分，可以通過(guò)抗菌免疫反應(yīng)輕松消除。因此，有必要鑒定和分離合適的共生細(xì)菌以降低處理排斥反應(yīng)。最近，椿象紅球菌LMG5362和BF02 2個(gè)共生微生物分別從其寄主長(zhǎng)紅列純(Rhodnius prolixus)和西花薊馬(Frankliniella occidentalis)分離得到。通過(guò)破壞RNaseIII基因，修飾2種細(xì)菌菌株，并用卵黃蛋白原和靶向α-微管蛋白的dsRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。通過(guò)人工飼料把這些細(xì)菌分別傳遞給昆蟲，這些細(xì)菌成功定殖于后腸，導(dǎo)致昆蟲60%～70%死亡。這項(xiàng)研究還表明，活細(xì)菌可以在同一代昆蟲之間傳播(水平傳播)，但不能傳遞給下一代。此外，攝入細(xì)菌定殖于后腸區(qū)域可能有利于產(chǎn)生RNAi，因?yàn)榇藚^(qū)域存在較低量dsRNA酶?？偟膩?lái)說(shuō)，該方法的主要挑戰(zhàn)是分離適當(dāng)?shù)墓采?xì)菌、轉(zhuǎn)化及其定殖。另一個(gè)限制因素是難以將細(xì)菌傳遞給刺吸式昆蟲。到目前為止，尚未研究過(guò)根灌或樹干注射法傳遞表達(dá) dsRNA的細(xì)菌。另外，為了用該方法替代農(nóng)藥，有必要考慮微生物感染其他動(dòng)物的可能性。RNAi的選擇性基因沉默還可以通過(guò)表達(dá) dsRNA的工程病毒的胞質(zhì)傳遞來(lái)實(shí)現(xiàn)，這可以導(dǎo)致更穩(wěn)定的基因下調(diào)。然而，相關(guān)研究只有一個(gè)，在此研究中，開發(fā)了針對(duì)3個(gè)黑腹果蠅基因(V型質(zhì)子ATP合成酶亞基E、40S核糖體蛋白S13和Coatomer α-亞基)的dsRNA的重組雞群病毒載體。然后通過(guò)微注射技術(shù)將這些載體施用于黑腹果蠅成年蠅中，結(jié)果表明，與未處理的對(duì)照組相比，所有靶向基因的表達(dá)水平降低了70%以上。盡管病毒載體以后可能替代經(jīng)口傳遞dsRNA的方法，但在某些情況下，使用病毒進(jìn)行dsRNA傳遞可能不是一種合適的策略，因?yàn)椴《究梢跃幋aRNAi抑制子，并且病毒誘導(dǎo)的沉默效應(yīng)可以通過(guò)編碼的RNAi 抑制子的特性來(lái)確定。最后，病毒的使用可能會(huì)存在安全問題，而這需要在田間應(yīng)用前就解決。

2.6 組合和堆疊處理

RNAi技術(shù)也可以與標(biāo)準(zhǔn)的作物保護(hù)策略互為補(bǔ)充，例如化學(xué)農(nóng)藥與靶向農(nóng)藥抗性基因的dsRNA一同應(yīng)用。此策略已成功用于柑橘重要害蟲柑橘木虱和柑橘綠化病的介質(zhì)。與僅用dsRNA處理的柑橘木虱相比，飼喂靶向谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的dsRNA以及2種殺蟲劑噻蟲嗪和苯丙酸菊酯后柑橘木虱的死亡率分別增加了23%和15%。這些研究也表明對(duì)此組合處理的反應(yīng)可能不同，即使是同一品種。因此，研究它們的作用方式和抗性途徑來(lái)確定更有潛力的RNAi靶標(biāo)很重要。白蟻是一種經(jīng)濟(jì)重要的害蟲，已用含有dsRNA的堆疊處理進(jìn)行防治。當(dāng)把作用于纖維素降解酶——內(nèi)切葡聚糖酶的 dsRNA和殺蟲劑氟蟲脲組合處理白蟻時(shí)，白蟻的死亡率與單獨(dú)氟蟲脲處理相比增加12%。

另一重組策略為在轉(zhuǎn)基因植物中堆疊 Bt-毒素和dsRNA性狀。蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt，一些菌株的Bt-毒素對(duì)昆蟲高毒，例如Cry1、Cry2、Cry3和Cry4。在30多年前就報(bào)道使用表達(dá)Bt-毒素的轉(zhuǎn)基因植物，實(shí)踐證明它們對(duì)一些危害一年生田間作物的害物非常有效。然而，一些品種對(duì)此毒素發(fā)展了抗性。能同時(shí)表達(dá)Bt-毒素和作用于抗性發(fā)展基因的dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物可能緩解在不知道是否存在抗性昆蟲種群的情況下部署B(yǎng)t形狀的擔(dān)憂。由此開發(fā)了玉米根蟲的抗性管理(IRM)工具。名為 SmartStax的轉(zhuǎn)基因植物最近被EPA管理委員會(huì)批準(zhǔn)，其表達(dá)2個(gè) Bt-毒素亞基(Cry3Bb1和Cry34Ab1/Cry35Ab1)和液泡分選蛋白。此植物預(yù)期能降低80%～95%玉米根蟲的出現(xiàn)，其持效性增加。最后，另一組合策略為飼喂昆蟲作用于不同基因的dsRNA的混合物。攝入 dsRNA后沉默效應(yīng)一般取決于靶標(biāo)基因的活力和組織表達(dá)水平。飼喂白蠟窄幾丁幼蟲和成蟲高濃度(10 μg/μL)的作用于熱應(yīng)激蛋白-70或shibire(2個(gè)重要基因)的dsRNA，昆蟲90%死亡。然而，一起低濃度施用(1 μg/μL) 2個(gè)dsRNA，二者具有增效作用，死亡率與上相似(約 90%)。飼喂赤擬谷盜 Bip和Armet dsRNA和BAPC納米粒子的復(fù)合物，也發(fā)現(xiàn)相似的作用。而2個(gè)dsRNA單獨(dú)與納米粒子的復(fù)合物進(jìn)行處理昆蟲的死亡率為25%，而組合處理的死亡率為 60%。有趣的是，作用于生命轉(zhuǎn)錄物的 11個(gè) dsRNA的組合，通過(guò)注射方法處理赤擬谷盜沒有增效作用。11個(gè) dsRNA單獨(dú)處理昆蟲死亡率80%～100%。因此，需要對(duì)此方法進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估來(lái)測(cè)定dsRNA靶標(biāo)的最佳數(shù)量和濃度范圍。

3 總結(jié)和未來(lái)

目前，至少2個(gè)管理機(jī)構(gòu)，加拿大食品檢驗(yàn)局和美國(guó)環(huán)保局已批準(zhǔn)RNAi害物管理方法。2個(gè)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)使用作用于玉米根蟲的轉(zhuǎn)基因作物。因此，剛開始認(rèn)識(shí)到 RNAi作為新的、創(chuàng)新害物管理方法的潛力。然而，有數(shù)個(gè)因素應(yīng)該考慮來(lái)確保經(jīng)口攝入dsRNA進(jìn)行害物管理的持續(xù)性，具體如下。

選擇靶標(biāo)基因：經(jīng)口dsRNA傳遞的效率取決于基因選擇、昆蟲品種和生命階段。靶基因的選擇至關(guān)重要，因?yàn)橹T如腸道 pH和核酸酶等生理障礙會(huì)阻礙dsRNA的吸收和在組織中的分布，從而影響傳遞到靶器官。對(duì)防治害蟲的 RNAi的主要研究集中在中腸的酶和蛋白質(zhì)?？傮w而言，針對(duì)與消化機(jī)制(例如-葡聚糖酶、絲氨酸蛋白酶)、防御機(jī)制(例如過(guò)氧化氫酶)和代謝(例如糖原合酶、幾丁質(zhì)酶)相關(guān)的基因的產(chǎn)品，已致昆蟲一定比率死亡。也已成功獲得其他針對(duì)運(yùn)動(dòng)、取食方法、溫度控制、生長(zhǎng)和發(fā)育的其他轉(zhuǎn)錄物。

dsRNA的特異性：設(shè)計(jì)或選擇 dsRNA序列是重要過(guò)程。例如液泡型APT合成酶和幾丁質(zhì)合酶基因常見于大多數(shù)昆蟲和其他生物。為了選擇高特異性dsRNA序列，應(yīng)該考慮以下2條：⑴ 與代理種(避免由于多態(tài)性而致的抗性)相比，選擇保守的序列，與各自靶標(biāo)基因有85%～100%的同源性；⑵ 排除與其他基因或昆蟲具有 19-mer(19-21核苷酸連續(xù)序列)同源性的 dsRNA序列，以避免非特異性或靶標(biāo)毒性。第 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(排除與其他昆蟲或基因具有 19-21 mer同源性的序列)更為關(guān)鍵，因?yàn)樗懦伺c其他生物中同一基因的任何siRNA互補(bǔ)片段。各種生物信息學(xué)工具(例如 E-RNAi，OfftargetFinder和MUSCLE)可用于設(shè)計(jì)dsRNA，可通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選以確定理想序列。在最近的一項(xiàng)研究中，將dsRNA注射入亞洲玉米螟，之后從昆蟲體內(nèi)提取到消化后的19～25 bp小siRNA片段。這些siRNA片段的序列在5'和3'末端具有保守的GGU點(diǎn)，這表明Dicer/RNase酶在剪接dsRNA時(shí)具有位點(diǎn)偏愛性。該知識(shí)可能有助于預(yù)測(cè)由特定 dsRNA序列產(chǎn)生的功能性siRNA片段。因此，將這些位點(diǎn)整合到dsRNA中，可以獲得更高的RNAi效應(yīng)。

dsRNA的長(zhǎng)度：dsRNA的自然吸收取決于長(zhǎng)度，研究人員測(cè)試了50～2 000 bp的dsRNA分子，它們經(jīng)Dicer加工后可產(chǎn)生約10～25的siRNA片段。然而，200～550 bp能更有效地啟動(dòng)RNAi效應(yīng)。一項(xiàng)最新研究通過(guò)飼喂2種鱗翅目幼蟲，將具有短串聯(lián)序列的 dsRNA(重復(fù)核苷酸序列的多個(gè)拷貝)與傳統(tǒng)的長(zhǎng)非串聯(lián)的dsRNA進(jìn)行了比較。要獲得相等的效應(yīng)，所需的串聯(lián)dsRNA(0.5 μg)的劑量要低于非串聯(lián)(2 μg)的。

RNAi機(jī)器的劑量和飽和度：dsRNA濃度和處理次數(shù)是昆蟲經(jīng)口傳遞 dsRNA有效性的主要決定因素。一些研究提出，需要持續(xù)較高濃度(＞1 μg)的dsRNA才能在昆蟲中誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)，以防止有害生物反復(fù)感染。然而，對(duì)橘小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)的研究表明重復(fù)使用 dsRNA會(huì)影響 RNAi的作用，使此害蟲難治。有趣的是低濃度的第2次使用縮短了難防治期，而較高濃度延長(zhǎng)了。從這項(xiàng)研究可以推斷出，多次小劑量比一次大劑量對(duì)復(fù)發(fā)性有害生物侵染更有效。經(jīng)口傳遞方式對(duì)昆蟲吸收dsRNA和dsRNA在昆蟲體內(nèi)的累積具有重要作用。太多的經(jīng)口傳遞的dsRNA分子可能引起dsRNA加工酶的飽和，也能影響整體基因表達(dá)方式。這可能對(duì)暴露于dsRNA處理的非靶標(biāo)品種更重要。對(duì)蜜蜂的研究檢查了dsRNA-GFP處理(飼喂)對(duì)工蜂的整體基因表達(dá)方式的影響。報(bào)道，由于dsRNA-GFP的影響約1 400個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了改變，而這約為蜜蜂基因組的 10%。這些基因參與與 RNA加工和運(yùn)輸、激素代謝、免疫以及對(duì)外部刺激和壓力的反應(yīng)相關(guān)的重要發(fā)育和代謝過(guò)程。

抗性：昆蟲可能通過(guò)2種機(jī)制對(duì)dsRNA發(fā)展抗性：⑴ 下調(diào)dsRNA加工機(jī)器或其突變；⑵ 降低昆蟲腸道對(duì)dsRNA的吸收。在田間和實(shí)驗(yàn)室中，給玉米根蟲飼喂表達(dá)DvSnf7 dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，玉米根蟲對(duì)dsRNA發(fā)展抗性。進(jìn)一步的分析表明，抗性基因存在于常染色體的單個(gè)位點(diǎn)上，并且是隱性遺傳。此外，靶基因的突變和多態(tài)性可導(dǎo)致dsRNA與mRNA序列不匹配，從而導(dǎo)致抗性的發(fā)展。多態(tài)性在自然界中很常見，并且與生物多樣性和進(jìn)化有關(guān)。通過(guò)使用生物信息學(xué)工具篩選更多潛在的靶標(biāo)及其多態(tài)性頻率，從而跨物種識(shí)別保守域，可以最大程度地減少由于多態(tài)性引起的錯(cuò)配。通過(guò)飼喂的RNAi具有巨大的潛力作為害蟲管理技術(shù)。但是，在將其用于害蟲防治之前，需要彌補(bǔ)一些知識(shí)空白。根據(jù)應(yīng)用dsRNA的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)，可能需要考慮與對(duì)非靶標(biāo)生物的潛在影響、dsRNA在環(huán)境中的命運(yùn)、足夠的劑量以及合適的給藥方法相關(guān)的擔(dān)憂。然而，基于RNAi的昆蟲防治新時(shí)代為有效地、對(duì)靶標(biāo)選擇性更高的害物管理提供了新機(jī)遇。