□ 李州霞 淮南市食品藥品檢驗(yàn)中心

有機(jī)磷農(nóng)藥是農(nóng)作物種植中廣泛應(yīng)用的農(nóng)藥，殺螟硫磷在有機(jī)磷農(nóng)藥中屬于毒性中等的農(nóng)藥，殺蟲的效果較好，因此也是常用的農(nóng)藥之一，被應(yīng)用在很多葉片類農(nóng)作物的生產(chǎn)中。而有機(jī)磷農(nóng)藥的大量應(yīng)用使得因農(nóng)藥殘留而中毒的事件在近期頻繁發(fā)生，因此，研究葉片類農(nóng)作物中殺螟硫磷含量的測(cè)定，對(duì)于提升農(nóng)作物安全性，降低因農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的中毒事件的發(fā)生有很大幫助[1]。

1 BIAcore技術(shù)

BIAcore技術(shù)是一種利用抗體親和原理進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，而本文中所提及的單鏈抗體（scFv）在檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)等有機(jī)物方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，其組織穿透力更強(qiáng)，且制備的技術(shù)成本更低，目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常將此方式用于檢測(cè)生物大分子，并且效果較好。但目前尚缺乏使用此方式檢測(cè)農(nóng)藥殘留的研究，而根據(jù)殺螟硫磷的結(jié)構(gòu)推測(cè)，其對(duì)單鏈抗體具備較強(qiáng)的親和力，因此使用BIAcore技術(shù)檢測(cè)茶葉中的殺螟硫磷殘留在理論上是可行的。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1材料

茶葉：云南普洱茶葉若干，包括使用殺螟硫磷的農(nóng)藥樣品500 g和未使用任何農(nóng)藥的樣品500 g。

儀 器：BIAcore X檢 測(cè) 系 統(tǒng)、其中包括CM5芯片、蛋白酶標(biāo)定儀（Model）、蛋白純化系統(tǒng)（HisLink）。

試劑：HEPES緩沖溶液、卵清白蛋白、含殺螟硫磷的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣品。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 單鏈抗體篩選

單鏈抗體的篩選分為表達(dá)與再篩選兩步，其中表達(dá)過(guò)程中，使用經(jīng)過(guò)核糖體篩選所獲得的殺螟硫磷的單鏈抗體基因，由pPOW載體嫁接后轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌中，作為批量表達(dá)和生產(chǎn)單鏈抗體的載體。

再篩選過(guò)程。選擇對(duì)殺螟硫磷抗性較強(qiáng)的卵清白蛋白，將之與CM5芯片偶聯(lián)后，將大腸桿菌所表達(dá)的蛋白質(zhì)溶液注入檢測(cè)系統(tǒng)中，從而在檢測(cè)系統(tǒng)中得到與殺螟硫磷親和力較強(qiáng)的抗體基因。

2.2.2 單鏈抗體的親和力

此過(guò)程分為純化和親和力分析兩步，在純化過(guò)程中，將上一步所獲得的與殺螟硫磷親和力較強(qiáng)的抗體基因注入蛋白純化系統(tǒng)中，得到純度更高的抗體蛋白。

在親和力分析中，將純化后的抗體蛋白使用HEPES緩沖溶液按照不同的濃度梯度比進(jìn)行稀釋，濃度梯度比為 8、4、2 mol/L與 1 mol/L， 將 所得到的溶液注入BIAcore X中，利用與儀器連接的分析軟件分析不同濃度的溶液與殺螟硫磷的親和力。

2.3 單鏈抗體特異性分析

利用上文中得到的與殺螟硫磷親和力較強(qiáng)的抗體，將其與含殺螟硫磷的農(nóng)藥和其他種類的有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)合，分析其余不同種類農(nóng)藥的親和力，為下一步實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備，下一步實(shí)驗(yàn)分為酶聯(lián)免疫分析和半抑制濃度的獲得以及交叉反應(yīng)率計(jì)算3步。

2.3.1 酶聯(lián)免疫分析

此過(guò)程利用酶聯(lián)板進(jìn)行，首先向酶聯(lián)板中加入80 μL單鏈抗體溶液，濃度為18 μg/mL，靜置一整夜后，于次日棄用酶聯(lián)板中的溶液，用磷酸鹽緩沖液清洗酶聯(lián)板后向其中加入不同種類和濃度梯度的有機(jī)磷農(nóng)藥，除殺螟硫磷外，還包括對(duì)硫磷、毒死蜱、三唑磷等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的有機(jī)磷農(nóng)藥。裝置在37 ℃下放置2 h后向其中加入硫酸終止反應(yīng)，使用蛋白酶標(biāo)定儀讀取酶聯(lián)板中的結(jié)合率（OD）值。

2.3.2 IC50的獲得

建立坐標(biāo)系，以有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制不同種類有機(jī)磷農(nóng)藥的結(jié)合率曲線圖，并通過(guò)曲線計(jì)算IC50。

2.3.3 交叉反應(yīng)率計(jì)算

交叉反應(yīng)率計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

2.4 茶葉中殺螟硫磷的測(cè)定

將茶葉搗碎，向其中加入少許丙酮，待溶液與丙酮充分混合后，進(jìn)行離心分離20 min，取上清液放置備用。

使用磷酸鹽緩沖液配制殺螟硫磷的濃度梯度溶液，由0 nmol/L至10 nmol/L，濃度梯度值為2，向其中加入制備好的單鏈抗體溶液，在室溫下靜置2 h，待抗體與殺螟硫磷充分結(jié)合后，將溶液注入BIAcore X系統(tǒng)中，選取其中包含殺螟硫磷的CM5芯片，讀取其響應(yīng)值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，篩選出其中親和力較高的抗體基因。

2.4.1 高親和力單鏈抗體的篩選

在參與篩選的65個(gè)抗體基因中，得到了3個(gè)與殺螟硫磷結(jié)合性較好的抗體基因，隨后對(duì)這3個(gè)抗體基因的結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和解離平衡常數(shù)進(jìn)行了測(cè)量，具體結(jié)果如表1所示。

在表1中，檢測(cè)抗體與抗原結(jié)合性能的關(guān)鍵指標(biāo)是解離平衡常數(shù)，該數(shù)值越小說(shuō)明抗體與抗原的親和力越強(qiáng)，從表1中可以看出，抗體ScFv-AF120與殺螟硫磷結(jié)合的能力最強(qiáng)，因此下文中將選擇此抗體作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)象。

2.4.2 殺螟硫磷含量的測(cè)定

選擇與殺螟硫磷抗原結(jié)合能力最強(qiáng)的抗體ScFv-AF120，將其與備用的上清液充分混合后注入到BIAcore X系統(tǒng)中，利用系統(tǒng)的分析軟件以不同質(zhì)量濃度下的RU值作為縱坐標(biāo)，以樣品溶液中的殺螟硫磷質(zhì)量濃度參數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖，如圖1所示。

通過(guò)計(jì)算圖1中的曲線，可以得到RU值的回歸方程，利用回歸方程，結(jié)合樣品提取液中的茶葉的質(zhì)量，可計(jì)算出茶葉中殺螟硫磷的含量約為0.124 mg/kg。

表1 3種抗體與殺螟硫磷抗原結(jié)合的性能

圖1 殺螟硫磷質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

國(guó)家對(duì)蔬菜類農(nóng)作物中殺螟硫磷的限值規(guī)定為0.5 mg/kg，可以看出云南普洱茶中的殺螟硫磷含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，符合質(zhì)量鑒定的要求。

2.5 樣品添加的回收率

向無(wú)農(nóng)藥的茶葉樣本中加入濃度為0.5、5、50 mg/kg的殺螟硫磷，并進(jìn)行回收率的檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 n=5時(shí)的樣品回收率和精密度檢驗(yàn)結(jié)果

從2中可以看出，樣品的回收率在94.5%～101.3%，RSD最大值為2.2%，這說(shuō)明此方式可以用于檢測(cè)茶葉中的殺螟硫磷含量。

3 結(jié)論

本文采用基于單鏈抗體的BIAcore法，對(duì)茶葉中的殺螟硫磷含量進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)抗體的篩選和特異性分析等步驟得出與抗原結(jié)合力最強(qiáng)的抗體，對(duì)云南普洱茶茶葉采用此方式進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得茶葉中的殺螟硫磷質(zhì)量濃度在0.124 mg/kg，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，符合質(zhì)量要求。此方式的樣品回收率在94.5%～101.3%，RSD最大值為2.2%，可以作為實(shí)際的檢測(cè)方案。