王立廣 張翔 黃貫劉 汪仁舉 康圣好 熊延軍 張奎

摘要?采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定兩系雜交水稻“荃兩優(yōu)2118”的種子純度。從48對(duì)SSR引物中篩選到2組引物（RM7120、RM8277）。隨機(jī)選取“荃兩優(yōu)2118”種子6組，每組樣品隨機(jī)取192棵種子苗種進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果顯示同一樣品SSR標(biāo)記與田間鑒定結(jié)果接近，最大、最小差異分別為2.05%和0.23%。因此，SSR標(biāo)記技術(shù)適用于“荃兩優(yōu)2118”的種子純度鑒定。

關(guān)鍵詞?SSR分子標(biāo)記;兩系雜交水稻;種子純度;田間鑒定

中圖分類號(hào)?S?511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0042-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.012

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Detection of Seed Purity of Two?line Hybird Rice “Quanliangyou 2118” by SSR Marker Technique

WANG Li?guang， ZHANG Xiang， HUANG Guan?liu et al

（Anhui Huaan Seed Co.， Ltd.， Hefei， Anhui 230031）

Abstract?The seed purity of two?line hybird rice “Quan liangyou 2118” was identified using simple sequence repeat （SSR） molecular markers. Two pairs of primers （RM7120 and RM8277） were screened out from 48 pairs of SSR primers. A total of 2 pairs of primers were used to test the purity of 6 groups of the “Quan liangyou 2118”， with 192 seed seedings in each group. The SSR identification results were basically agreed with the field identification results， the difference of which ranged from 0.23%-2.05%. The research results indicated that SSR markers could be utilized to identify the purity of “Quan liangyou 2118”.

Key words?Simple sequence repeat （SSR） molecular markers;Two?line hybrid rice;Seed purity;Field identification

雜交水稻質(zhì)量的核心指標(biāo)是種子純度，因此準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)雜交水稻種子的純度是種子企業(yè)在生產(chǎn)加工銷售中最關(guān)心的問(wèn)題[1]。兩系雜交水稻種子純度檢驗(yàn)的方法有很多，目前被種子企業(yè)廣范運(yùn)用的方法主要為田間種植鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定。其中，田間鑒定是目前運(yùn)用最廣、最有效、最準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，田間鑒定主要通過(guò)海南加代種植或正季種植，在抽穗前及齊穗后多次進(jìn)行觀察記載，比較各單株間的植物學(xué)特征，通過(guò)品種的農(nóng)藝特征特性鑒別真實(shí)雜交種及雜株[2]。不同品種或品系間存在大量的DNA序列差異，其中微衛(wèi)星序列廣泛分布在每條染色體上，SSR分子標(biāo)記鑒定種子的純度正是利用這種DNA序列的差異達(dá)到檢測(cè)的目的。此外，SSR標(biāo)記具有成本低、數(shù)量豐富、結(jié)果穩(wěn)定、試驗(yàn)周期短等特點(diǎn)，因而SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于雜交種子的純度鑒定[3]。

鑒于此，筆者利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，對(duì)荃兩優(yōu)2118母本及父本進(jìn)行多態(tài)性篩選，篩選出了2對(duì)特異性好的引物（RM7120、RM8277），并且這2對(duì)引物對(duì)荃兩優(yōu)2118的雙親均顯示出很好的多態(tài)性，在荃兩優(yōu)2118上顯示出共顯性特征，因此適宜于對(duì)這2對(duì)引物進(jìn)行純度鑒定。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

試驗(yàn)材料兩系雜交水稻“荃兩優(yōu)2118”及親本樣品由安徽華安種業(yè)有限責(zé)任公司提供。2108年入庫(kù)的種子中，隨機(jī)選取了6個(gè)批次的雜交種子，分別編號(hào)為18-1、18-2、18-3、18-4、18-5、18-6。在光照培育箱中培育7 d，取合適的幼苗進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。試驗(yàn)所用的Tag酶為T(mén)aKaRa的高保真酶，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?DNA模板的制備。①親本DNA的提取。分別取父本與母本的種子苗嫩葉0.2 g左右，分別裝入2.0 mL離心管中。用液氮冷凍后磨碎，加入提取液，水浴，再加入三氯甲烷、異戊醇、乙醇等試劑，提取DNA。②雜交種子苗的DNA提取。首先，將上述已培育7 d左右的幼苗每個(gè)批次隨機(jī)取192棵，每棵幼苗剪取1～2 cm左右的嫩葉，分別置于96孔PCR板中;其次，在PCR板孔中加入90 μL的1 mol/L NaOH溶液，確保將植物組織完全浸泡，沸水浴5 min;然后，在PCR板孔中加入45 μL的1 mol/ Tris-HCL（pH 8.0），沸水浴1 min;最后，再分別加入45 μL的TE（pH 8.0），靜止片刻后吸取2.0 μL液體作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板[4]。

1.2.2

DNA指紋鑒定。PCR擴(kuò)增引物采用SN/T3402-2012《兩系雜交水稻與親本真實(shí)性及品種純度鑒定DNA分析法》中用于純度鑒定的48對(duì)SSR多態(tài)性引物[5]。PCR擴(kuò)增體系（總體積10 μL）：10×Buffer 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/mL的上下游引物各0.2 μL，Tag酶0.6 μL，按上述方法制備DNA模板2.0 μL，ddH2O 5.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性2 min，進(jìn)行32次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)：94 ℃下變性45 s，55 ℃下退火45 s，72℃下延伸1 min。然后72 ℃下延伸8 min，至最后10 ℃恒溫。將PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳及染色檢測(cè)，觀察膠片并記錄結(jié)果[6]。

1.2.3?田間種植鑒定。每個(gè)批次在海南田間種植1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植400株，單苗移栽，并設(shè)親本對(duì)照。在整個(gè)生長(zhǎng)階段檢查小區(qū)的種植情況，觀察品種的特征特性，注意減少化肥、除草劑的使用，以免影響植株的特征特性。在抽穗前及齊穗后依據(jù)GB/T 3543.5-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定》進(jìn)行田間純度鑒定，根據(jù)品種特征特性鑒定并記錄下雜株類型和數(shù)量[7]。

2?結(jié)果與分析

2.1?“荃兩優(yōu)2118”F1種子特異性引物的篩選

試驗(yàn)參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3402-2012《兩系水稻品種真實(shí)性與純度鑒定 DNA分析法》，對(duì)48對(duì)引物進(jìn)行篩選，最后選擇RM7120和RM8277作為“荃兩優(yōu)2118”F1種子純度SSR鑒定引物。引物RM7120的上游為5′-TGCCCAAAATATATGAAACC-3′，下游為5′-TTTTCTTGTTGAATGGGAAC-3′;引物RM8277的上游為5′-AGCACAAGTAGGTGCATTTC-3′，下游為5′-ATTTGCCTGTGATGTAATAGC-3′。

2.2?DNA指紋鑒定與田間種植鑒定結(jié)果的比較

利用引物RM7120和RM8277對(duì)6批“荃兩優(yōu)2118”各96棵幼苗進(jìn)行SSR分子標(biāo)記鑒定，田間鑒定種植400株，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，SSR分子標(biāo)記與田間鑒定結(jié)果比較接近，差值最大為2.05%，差值最小為0.23%。圖1為利用引物RM7120進(jìn)行SSR鑒定的電泳結(jié)果，M1、M2雙親的帶型為單一帶型，雜交種1、2、3、4、5、7、8為雜合帶型并具有雙親的帶型，自交結(jié)實(shí)的不育系6的帶型與不育系M2一致。

3?結(jié)論與討論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性，其中SSR標(biāo)記由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上的共顯性、試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標(biāo)記[8]。相比較而言，田間種植鑒定是目前公認(rèn)的雜交水稻種子純度鑒定中比較可靠、準(zhǔn)確的鑒定方法，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的、目前鑒定雜交水稻種子純度應(yīng)用最廣泛的方法之一[9]。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，SSR鑒定與田間鑒定所得雜交水稻種子純度存在差異，并且差異的變化無(wú)規(guī)律可尋。這一方面是因?yàn)镾SR標(biāo)記可準(zhǔn)確區(qū)分不育系和恢復(fù)系，但對(duì)于竄粉混雜和變異株較難區(qū)分，此外SSR鑒定的準(zhǔn)確性也受到DNA提取質(zhì)量、電泳操作和引物的影響;另一方面是因?yàn)樘镩g種植鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確性受到鑒定者的經(jīng)驗(yàn)、栽培管理、環(huán)境條件等因素干擾[6]。但總體來(lái)看，SSR鑒定與田間種植鑒定的結(jié)果十分接近。

對(duì)于企業(yè)而言，種子入庫(kù)后到播種之前開(kāi)始包裝銷售，而海南加代種植鑒定需要在次年4月份才能得到鑒定結(jié)果。為了給包裝銷售提供可靠的質(zhì)量依據(jù)，就需要在室內(nèi)先進(jìn)行純度鑒定。在實(shí)際操作中，應(yīng)采用以室內(nèi)鑒定為輔，田間鑒定為主的理念指導(dǎo)種子的生產(chǎn)加工。研究掌握室內(nèi)檢測(cè)與田間鑒定結(jié)果的關(guān)系可以更清楚地了解品種特性，而DNA指紋鑒定是一種快速、可靠、優(yōu)良的雜交水稻種子純度鑒定方法[10]。

參考文獻(xiàn)

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