胡江濤 何成艷 劉興睿 俞凌云 于剛 薛康

摘要?[目的]建立固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品中8種禁用色素（堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、羅丹明6G、分散紅1、柑桔紅2）。[方法]樣品經(jīng)乙酸銨和甲醇提取，經(jīng)固相萃取柱凈化，用液相串聯(lián)質(zhì)譜測定。測定8種禁用色素同時進(jìn)行了液相色譜條件及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，選擇最佳條件進(jìn)行測定，優(yōu)化的條件下進(jìn)行測定每種色素，計算出濃度。重復(fù)測定5次，計算方法精密度。[結(jié)果]堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、羅丹明6G、分散紅1和柑桔紅2的精密度分別為4.79%、5.82%、5.13%、4.88%、3.09%、4.38%、4.60%、5.30%。[結(jié)論]選擇最佳條件后，固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法能有效地檢測出食品中8種禁用色素，滿足工業(yè)檢測要求。

關(guān)鍵詞?食品;禁用色素;測定;固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號?TS?207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0204-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.061

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Simultaneous Determination of Eight Banned Pigments in Food by Solid Phase Extraction?Ultra Performance Liquid Chromatography?Tandem Mass Spectrometry

HU Jiang?tao1，HE Cheng?yan2，LIU Xing?rui1 et al

（1. Technical Center of Chengdu Customs， Food Safety Detection Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu，Sichuan 610041; 2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu，Sichuan 611137）

Abstract?[Objective] The research aimed to establish a solid phase extraction?ultra performance liquid chromatography?tandem mass spectrometry for simultaneous determination of eight banned pigments in foods （basic orange 2，auramine O， basic orange 21， basic orange 22， rhodamine B， rhodamine 6G， disperse red 1， citrus red 2）.[Method] The sample was extracted with ammonium acetate and methanol， purified by a solid phase extraction column， and determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry.Eight kinds of banned pigments were measured， and liquid chromatography conditions and mass spectrometry conditions were optimized. The optimum conditions were selected for measurement， and each pigment was measured under optimized conditions to calculate the concentration.Repeat the measurement 5 times to calculate the precision of the method.[Result]The precision of basic orange 2，auramine O; basic orange 21， basic orange 22， rhodamine B， rhodamine 6G， disperse red 1 citrus red 2 were 4.79%， 5.82%， 5.13%，4.88%， 3.09%， 4.38%， 4.60%， 5.30%，respectively.[Conclusion]After selecting the optimum conditions， the solid phase extraction?ultra?high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method can effectively detect 8 kinds of banned pigments in foods and meet the industrial testing requirements.

Key words?Food;Banned pigment;Detection;Solid phase extraction?ultra?high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method

洪紅等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在辣椒制成的調(diào)味品、有色彩的水果醬類、熟食及腌制肉制品、飲料及果酒類、谷類食品、堅果類食品及家禽產(chǎn)品中易添加工業(yè)色素，因此這些類別食品為重點檢測對象。鄭小嚴(yán)[2]研究發(fā)現(xiàn)，堿性橙類、堿性嫩黃O等易在中性及偏堿性條件下與蛋白質(zhì)吸附，不易褪色，并對消費者健康造成極大傷害具有致癌、致畸作用。根據(jù)阮成旭等[3]的研究，羅丹明B對人體具有極大危害，長期食用會導(dǎo)致死亡。因此需要一個能夠準(zhǔn)確快速檢測出食品中違禁色素的方法，來保證食品行業(yè)安全。目前食品中色素的檢測方法多種多樣，如薄層色譜法、分光光度法、極譜法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、免疫學(xué)方法、紅外光譜、拉曼光譜法等[4-10]，各有各的優(yōu)點及缺點，食品檢驗檢測機構(gòu)一般運用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，因為此方法滿足準(zhǔn)確度、靈敏度要求，并且適用大批量檢測。

筆者選擇以固相萃取為凈化樣品配合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中8種禁用色素的方法。

1?材料與方法

1.1?試驗原理

食品中8種禁用色素（堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、羅丹明6G、分散紅1、柑桔紅2）先后經(jīng)50 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇提取，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。

1.2?試劑與材料

除另有說明外，該方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水;乙腈、甲醇、甲酸、氨水、乙酸銨（色譜純）;Oasis HLB 固相萃取柱;8種禁用色素標(biāo)準(zhǔn)品：堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、羅丹明6G、分散紅1、柑桔紅2，純度均大于等于90%。

1.3?儀器和設(shè)備?高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，配有電噴霧離子源）;分析天平;具塞離心管;渦旋混合器;超聲波清洗器;離心機;組織搗碎機;氮吹儀。

1.4?測定步驟

1.4.1?樣品前處理方法。

1.4.1.1?提取。

稱取2.0 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入50 mmol/L乙酸銨溶液10 mL，渦旋混勻，超聲提取30 min，以10 000 r/min的速度離心，收集上清液;再向殘渣中加入10 mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取30 min，以10 000 r/min的速度離心，收集上清液。合并2次上清液，混勻，待凈化。

1.4.1.2?凈化。

準(zhǔn)確移取2.0 mL上述提取液，在40 ℃下經(jīng)N2吹干后，用2%乙腈水溶液3.0 mL溶解殘渣，待上柱。分別用3.0 mL甲醇和水活化Oasis HLB固相萃取柱，上樣，控制樣品過柱速度為30滴/min。依次用3.0 mL 5%氨水-乙腈溶液、1.0 mL乙腈進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，待濃縮。

1.4.1.3?濃縮。

收集上述洗脫液，在40 ℃下經(jīng)N2吹干后，用0.1%甲酸+甲醇溶液（70+30，V/V）溶解定容至1.0 mL，混勻，待進(jìn)樣分析。

1.4.2?儀器分析條件。

1.4.2.1?液相色譜分離條件。

色譜柱：Eclipse XDB C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 L;流速0.2 mL/min;流動相：甲醇∶0.1 %甲酸水溶液=3∶7，梯度洗脫程序見表1。

1.4.2.2?質(zhì)譜分析條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;質(zhì)譜參考條件：電噴霧電壓5 500 V;霧化器壓力413.69 kPa;氣簾氣壓力103.42 kPa;碰撞氣壓力41.37 kPa;離子源溫度550 ℃。

1.4.3?液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

根據(jù)樣液中待測物的含量，選定濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一起進(jìn)行色譜分析。待測樣液中8種禁用色素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣液等體積參插進(jìn)樣測定。

1.4.4

定性檢測。按照上述條件測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，樣品中待測物色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的保留時間偏差應(yīng)一致，允許偏差小于±2.5%;并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，相對離子豐度>50%的最大允許誤差不超過±20%;>20%～50%不超過±25%;>10%～20%不超過±30%，最大不超過±50%;≤10%不超過±50%，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。

1.5?空白試驗

除不加試樣外，均按“1.4”測定步驟進(jìn)行。

1.6?結(jié)果計算和表述

用LC-MS/MS的數(shù)據(jù)處理軟件或按下式（1）計算試樣中8種禁用色素的含量，計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。

X=A×c×VAs×m（1）

式中，X為試樣中色素含量（μg/kg）;

A為樣液中色素的峰面積;

c為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中色素的濃度（ng/mL）;

V為樣品溶液最終定容體積（mL）;

As標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中色素的峰面積;

m為樣品溶液所代表最終試樣的質(zhì)量（g）。

2?結(jié)果與分析

2.1?檢測離子對的選擇及其質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用甲醇-0.1%甲酸（3∶7，V/V）配制濃度為1.0 μg/mL的8種禁用色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用注射器泵的輸注方式直接將混標(biāo)溶液（1.0 μg/mL）分別以10.0 μL/min的流速輸入質(zhì)譜，進(jìn)行離子對選擇試驗。該試驗采用的離子源是ESI離子源，它兼具使化合物軟性電離和液相色譜與質(zhì)譜接口的作用。

檢測8種被測物質(zhì)的質(zhì)譜條件見表2。每對MRM離子對的去族電壓（DP）與碰撞電壓（CE）通過觀察改變這2個參數(shù)對信號豐度的影響以反復(fù)優(yōu)化，選擇能產(chǎn)生豐度高的MRM信號的DP、CE值作為檢測條件。以信號強度最高的MRM監(jiān)測離子對作為定量離子，次強的作為定性離子。各物質(zhì)的Q3掃描圖見圖1。

之后繼續(xù)優(yōu)化質(zhì)譜離子源的其他參數(shù)。這些參數(shù)大多不能針對單個離子進(jìn)行優(yōu)化，其中重要的參數(shù)包括CUR、Gas1、Gas2、IS、TEM，故通過質(zhì)譜儀自帶軟件對其進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為氣簾氣CUR：103.42 kPa，霧化氣Gas1：413.69 kPa，輔助氣Gas2：482.63 kPa，電噴霧電壓IS：5 500 V，源溫度TEM：550 ℃，碰撞氣入口電壓EP：12.00 V，碰撞氣出口電壓CXP：12.00 V。

2.2?液相條件的優(yōu)化與選擇

2.2.1?色譜柱的選擇。

試驗考察了CAPCELL PAK-C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）和Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）

2種色譜柱對8種禁用色素的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種待測組分由Agilent SB-C18色譜柱分離時，無論是峰形還是靈敏度均要優(yōu)于Eclipse XDB C18色譜柱。因此該試驗選用Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分離。

2.2.2?流動相的優(yōu)化。

常用的流動相是甲醇和乙腈，由于采用正離子模式，流動相中水相的選擇多用水、甲酸、乙酸等。該試驗比較了乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-水、乙腈-水對8種違禁色素分離的影響，結(jié)果表明，甲醇-0.1%甲酸溶液的流動相體系優(yōu)于其他體系，結(jié)果見圖2。當(dāng)采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，8種待測成分不能同時實現(xiàn)完全分離，且柑桔紅峰形不好。當(dāng)采用甲醇-水作為流動相時，待測組分分離不好，因此最終確立了甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相。

流動相的組成和比例不同也會影響待測物的分離效果。該試驗通過多次調(diào)整甲醇和0.1%甲酸的比例對洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。在固定其他液相色譜條件的基礎(chǔ)上，探索多個梯度洗脫程序?qū)Ψ蛛x結(jié)果的影響，最終確立的梯度分析程序如表3所示。

2.3?方法的線性范圍、回歸方程、檢出限及定量限

用水稀釋8種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)線性方程，以基線噪聲的3倍信號響應(yīng)值計算方法的檢出限（LOD），以基線噪聲的10倍信號響應(yīng)值計算方法的定量限（LOQ），結(jié)果見表4。

2.4?方法的精密度?用水稀釋8種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行測定每種色素，計算出濃度。重復(fù)測定5次，計算方法精密度，其中，堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21、堿性橙22、羅丹明B、羅丹明6G、分散紅1和柑桔紅2的精密度分別為4.79%、5.82%、5.13%、4.88%、3.09%、4.38%、4.60%、5.30%。

2.5?方法的回收率

選擇目標(biāo)待測物質(zhì)，添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)使其成為低（1.0 μg/mL）、中（10.0 μg/mL）、高（25.0 μg/mL）3種濃度來考察該方法的回收率，如表5。

3?結(jié)論與討論

針對8種食品中禁用色素，該方法經(jīng)過色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化，確定了最佳測定條件，在10 min內(nèi)就可以檢測8種禁用色素，在快速的基礎(chǔ)上方法的精密度達(dá)到了 3.09%～5.82%，回收率達(dá)到了92.0%～ 108.0%，因此該方法可以作為實驗室檢測目標(biāo)色素的一個參考方法。

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