杜紅霞，聶嘉俊，馮雅瓊，劉建英，黃麗麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

近年來(lái)蘋果產(chǎn)業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅猛，其種植面積與總產(chǎn)量均位居世界第一，而蘋果樹腐爛病卻嚴(yán)重制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病是由Valsamali=Cytosporamali引起的一種真菌性病害，主要危害蘋果樹枝干，輕則樹枝樹干枯死，蘋果減產(chǎn)，重則造成絕產(chǎn)甚至毀園。因此深入揭示該病原菌的分子致病機(jī)理對(duì)病害高效防控意義重大。

真核生物的遺傳信息通常存儲(chǔ)在高度壓縮的染色質(zhì)中，因此，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)在基因的表達(dá)調(diào)控中具有重要意義。真核生物在進(jìn)化中產(chǎn)生的各類染色質(zhì)重塑因子，利用ATP水解的能量對(duì)染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)核小體進(jìn)行改裝，進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)參與對(duì)基因的調(diào)控[1]。染色質(zhì)重塑因子根據(jù)功能域劃分為SWI/SNF、ISWI、CHD和INO80/SWR1[2]。INO80染色質(zhì)重塑因子最早在釀酒酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[3]，由15種不同的亞基組成，能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多個(gè)基因的表達(dá)，結(jié)合在INO80不同結(jié)構(gòu)域上的不同亞基形成了3個(gè)主要的功能區(qū)：(1)N端調(diào)控功能區(qū)：包括亞基les1、les3、les5和Nhp10；(2)HSA功能區(qū)：包括亞基Arp4、Arp8和les4；(3)SNF2-ATPase功能區(qū)：包括AAA+ATPase(Rvb1和Rvb2)、Arp5、les2和les6亞基[4]。

INO80染色質(zhì)重塑因子及其亞基參與多種細(xì)胞過(guò)程且功能多樣。如擬南芥INO80缺失突變體植株表現(xiàn)為弱化矮小且重量減少[5]；醫(yī)學(xué)方面的研究發(fā)現(xiàn)，沉默肺癌細(xì)胞INO80、肺癌細(xì)胞的形成速率明顯下降[6]，另外，癌細(xì)胞中敲除了INO80后發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[7]，而酵母細(xì)胞中Nhp10亞基缺失導(dǎo)致INO80對(duì)DNA結(jié)合活性降低[8]，缺失les3基因的酵母細(xì)胞端粒伸長(zhǎng)并且位置發(fā)生改變[1]，并且缺失INO80催化亞基或Arp5-Ies6核心亞基的酵母細(xì)胞基因組內(nèi)15%的基因表達(dá)受到影響[9]。因此，揭示INO80及其亞基在腐爛病菌致病中的作用具有重要價(jià)值。本研究從V.mali全基因組數(shù)據(jù)[10]中鑒定到一個(gè)染色質(zhì)重塑因子INO80亞基基因Vmles4，利用缺失突變體揭示該基因?qū)Σ【鸂I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、致病力的影響，同時(shí)探索其對(duì)致病相關(guān)次級(jí)代謝合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的影響，這將有助于進(jìn)一步揭示染色質(zhì)重塑因子在腐爛病菌致病中的功能。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來(lái)源 蘋果樹腐爛病菌(Valsamali=Cytosporamali)野生型分離菌株03-8，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治研究團(tuán)隊(duì)的研究室分離并保存；pFL2質(zhì)粒(含有Trp合成基因neo，G418抗性)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮教授惠贈(zèng)。

1.1.2 致病性測(cè)定材料 蘋果樹葉片和枝條均為采自楊凌美庭快樂農(nóng)場(chǎng)的富士品種，葉片為表面平整的初夏葉片，枝條為粗細(xì)均勻的1～2 a生枝條。

1.1.3 主要試劑 P505高保真酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，諾維贊)、DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit D2500，OMEGA)、崩潰酶(Driselase，Sigma)、裂解酶(Lysing enzyme，Sigma)、Taq DNA聚合酶、定量Mix(Genstar)、G418(MP)、華越洋核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)及其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)化學(xué)藥品和試劑，試驗(yàn)中所需引物均委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成。實(shí)驗(yàn)用到的引物序列見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Vmles4的侵染表達(dá)模式分析 將活化好的野生型菌株03-8的菌餅接種于健康的離體富士枝條上，取6、12、24、48、72 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病健交界處皮層組織樣品，以純培養(yǎng)72 h的菌絲組織為對(duì)照，按照核酸提取試劑盒(華越洋)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)說(shuō)明書操作進(jìn)行總RNA的提取并合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物采用Oligod(T)18，以G6PDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算Vmles4相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)反應(yīng)3次平行重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

1.2.2 突變體的獲得 基于本實(shí)驗(yàn)室前期的病菌全基因組測(cè)序分析結(jié)果得到目的基因序列，用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物qRT-F/qRT-R，上游引物1F/2R，下游引物3F/4R，巢氏引物CF/CR，檢測(cè)引物5F/6R。其中引物2R和3F的5′端帶有同G418兩端同源的序列(斜體序列)。以蘋果樹腐爛病菌的基因組DNA(1 402 ng·μl-1)為模板，擴(kuò)增目的基因的上下游片段，以pFL2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增neo基因片段，回收各個(gè)擴(kuò)增片段，用Double-joint PCR三步法構(gòu)建基因敲除載體，用PEG介導(dǎo)法將敲除載體導(dǎo)入原生質(zhì)體中，含有200 μg·mL-1G418抗生素的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿篩選轉(zhuǎn)化子，提取其DNA，4對(duì)引物PCR檢測(cè)后得到3個(gè)陽(yáng)性突變體，將其保存在20%的甘油中并于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 表型分析 活化好的野生型03-8及突變體菌株，用打孔器(d=5 mm)在菌落邊緣打菌餅，接種在含有12 ml PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，25℃黑暗培養(yǎng)48 h后，觀察菌落的生長(zhǎng)情況并用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

1.2.4 致病力測(cè)定 離體葉片接種參照韋潔玲等[11]的方法。葉片用自來(lái)水沖洗干凈后，用0.6%的次氯酸鈉(NaClO)溶液消毒5 min，用滅菌ddH2O水沖洗3次，每次5 min，一次性1 ml注射器針頭刺傷葉片正面制造傷口，用直徑為5 mm的打孔器在活化好的菌落邊緣打孔制成菌餅，再將菌餅接種在葉片正面的傷口上，以PDA為空白對(duì)照，滅菌的脫脂棉蘸纏于葉柄防止水分的散失，葉片置于托盤內(nèi)25℃保濕培養(yǎng)，3～4 d后用十字交叉法測(cè)量葉片病斑的大小，每個(gè)菌株設(shè)置5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。離體枝條接種參照臧睿等[12]的方法。將枝條剪成10 cm左右的小段，自來(lái)水沖洗干凈，0.6%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒15 min，用滅菌ddH2O水沖洗3次，待其晾干，融化的石蠟將枝條兩端封口，打孔器(d=5 mm)在枝條上破壞其韌皮組織打孔制造傷口，用打孔器(d=5 mm)將活化好的野生型及突變體菌株打菌餅，菌餅接種在枝條制造的傷口上，野生型菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，25 ℃保濕培養(yǎng)，7 d后測(cè)量并記錄枝條病斑縱向擴(kuò)展長(zhǎng)度，每個(gè)菌株設(shè)置6個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

1.2.5VmNRPS12及VmNRPS14表達(dá)量 參照1.2.1小節(jié)的方法枝條接種野生型03-8與突變體菌株ΔVmles4，取接種后24 h的樹皮組織(以純培養(yǎng)菌絲體為對(duì)照)，提取RNA并合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)NRPS12及NRPS14基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次后取均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 侵染期Vmles4的表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析Vmles4在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖1，Vmles4在病菌接種6 h顯著上調(diào)表達(dá)，上調(diào)達(dá)6.2倍。說(shuō)明該基因在蘋果樹腐爛病菌侵染前期發(fā)揮重要作用并且可能參與致病過(guò)程。

注：試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。利用SPSS 23.0分析差異顯著性。*表示顯著性差異(0.01

2.2 敲除突變體的獲得

Vmles4上下游片段的擴(kuò)增，片段大小分別為1683 bp和1688 bp(見圖2A)；抗性基因neo片段擴(kuò)增片段大小為1433 bp(圖2B)；Double-joint PCR融合上游、下游和neo片段，片段大小為4804 bp(圖2C)；CF/CR巢式PCR構(gòu)建敲除載體，片段大小為4595 bp(圖2D)；PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化方法得到轉(zhuǎn)化子，用4對(duì)引物檢測(cè)后得到3個(gè)基因缺失突變體(圖3)。

注：(A)：Vmles4上下游片段擴(kuò)增； F：目標(biāo)上游片段； L：目標(biāo)下游片段； M：DL2000 marker；(B)：neo基因擴(kuò)增 M：DL2000 marker；(C)-(D)：構(gòu)建敲除載體 Ⅰ：Double-joint PCR融合基因片段； Ⅱ and Ⅲ：巢式PCR片段； M：DL5000。Note: (A)：Amplification of upstream and downstream of Vmles4; F：target upstream; L：target downstream; M：DL2000 marker; (B)：Amplification of neo cassette； M：DL2000 marker；(C)-(D)：Construction of the knockout vector； Ⅰ：fusion fragment of double-joint PCR； Ⅱ and Ⅲ：nested PCR fragment； M：DL5000.

1：目的基因 The target gene；2：neo基因 neo cassette；3：上游片段 Upstream region；4：下游片段 Downstream region；5：陰性對(duì)照 Negative control；6：陽(yáng)性對(duì)照 Positive control;M：DL2000 marker

2.3 突變體的表型觀察

在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，與野生型菌株03-8相比，Vmles4突變體菌落較白、菌絲較稀少，生長(zhǎng)速率平均下降達(dá)28%，且生長(zhǎng)不規(guī)則(圖4)。表明Vmles4基因影響菌落的形態(tài)和生長(zhǎng)速率。

注：試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。利用SPSS23.0在P=0.05水平上分析差異顯著性。不同小寫字母表示兩者間存在顯著差異。下同。Note: The expriment was repeated three times and the mean value was taken. SPSS23.0 was used to analyze the difference at 0.05 level. Different lowcase letters indicate significant differences between the two strains. The same below.

2.4 突變體致病力的測(cè)定

與野生型03-8相比，Vmles4缺失突變體分別在離體葉片上病斑直徑平均下降22.5%，在枝條上病斑長(zhǎng)度平均下降27%(圖5)。表明Vmles4基因的缺失使病原菌在葉片和枝條上的致病力下降。

圖5 野生型菌株03-8及突變體ΔVmles4的致病力測(cè)定及分析

2.5 ΔVmles4對(duì)VmNRPS12及VmNRPS14表達(dá)量的影響

VmNRPS12和VmNRPS14基因在野生型03-8及ΔVmles4菌株侵染樹皮24 h的qRT-PCR結(jié)果顯示(圖6)，VmNRPS12和VmNRPS14在ΔVmles4菌株中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于野生型，分別下調(diào)86.5%和50%(圖6)。表明Vmles4正調(diào)控了基因VmNRPS12和VmNRPS14的表達(dá)。

圖6 VmNRPS12和VmNRPS14基因在野生型03-8和突變體ΔVmles4侵染枝條24 h的相對(duì)表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

本研究就蘋果樹腐爛病菌染色質(zhì)重塑因子INO80亞基Vmles4基因在V.mali中的功能進(jìn)行了初步探究。Vmles4在接種離體蘋果樹枝條6 h后的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)；有文獻(xiàn)報(bào)道，真菌中一些起作用的致病基因在侵染初期會(huì)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的情況[13]，這與本研究對(duì)侵染期Vmles4表達(dá)模式分析結(jié)果相符，說(shuō)明Vmles4是一類毒性基因，可能參與致病。與野生型03-8比較，3個(gè)敲除突變體的生長(zhǎng)速率及其在葉片和枝條上的致病力均顯著下降，說(shuō)明Vmles4基因確實(shí)參與了致病。對(duì)擬南芥染色質(zhì)重塑因子核心亞基的研究發(fā)現(xiàn)，其參與了多種發(fā)育過(guò)程[14]，且缺失INO80基因后，植株生長(zhǎng)受到限制；INO80重塑因子的N端調(diào)控域與HAS功能區(qū)Arp4 Arp8 les4亞基結(jié)合后，改變亞基Arp8的構(gòu)象，構(gòu)象改變后的Arp8與核小體上的組蛋白結(jié)合緊緊抓住核小體，隨后亞基Arp5-les6將SNF2-ATPase功能區(qū)Rvb蛋白亞基募集過(guò)來(lái)[15]，Rvb1和Rvb2亞基具有螺旋酶的活性[16]，Rvb1和Rvb2與其他的亞基結(jié)合后，在超螺旋位置與核小體上的DNA結(jié)合，打開堿基，并阻止組蛋白H2A與DNA的接觸[17]，將核小體上的DNA暴露出來(lái)，便于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等結(jié)合；INO80亞基間通過(guò)以上方式共同合作重塑染色質(zhì)，來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。

本研究對(duì)致病基因VmNRPS12[17]及NRPS類相關(guān)基因VmNRPS14在INO80亞基Vmles4突變體中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)能力顯著下降。酵母和Hela細(xì)胞INO80亞基缺失后，基因組內(nèi)基因也出現(xiàn)上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象，與本研究中Vmles4缺失后，VmNRPS12和VmNRPS14基因的表達(dá)量出現(xiàn)下降相符。本研究中位于HAS功能區(qū)的亞基Vmles4基因缺失后，病菌的致病力顯著下降。有文獻(xiàn)報(bào)道，HAS功能區(qū)與核小體組蛋白及DNA的結(jié)合有關(guān)[18]，Vmles4導(dǎo)致致病性下降的原因可能是Vmles4缺失后，致病基因的轉(zhuǎn)錄因子等無(wú)法與DNA結(jié)合，使得致病基因的表達(dá)下降，無(wú)法發(fā)揮毒性功能最終導(dǎo)致了致病力的降低。本研究只是初步探究了染色質(zhì)重塑因子INO80亞基Vmles4基因的毒性功能及其對(duì)VmNRPS12及VmNRPS14表達(dá)的調(diào)控功能，然而蘋果樹腐爛病的致病是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，INO80染色質(zhì)重塑因子作為一類由多亞基組成的保守調(diào)控因子，各個(gè)亞基之間到底以怎樣的相互作用來(lái)影響V.mali的致病和調(diào)控能力將會(huì)是一個(gè)新的研究方向。