汝晶 陳嶸 鄭梅 李明泓 張珊

【摘?要】?目的：研究烏頭堿抑制人胃腺癌細(xì)胞系MGC803增殖的miRNA水平作用機制。方法：烏頭堿作用于MGC803細(xì)胞后，MTT實驗檢測細(xì)胞活力并確定后續(xù)實驗中烏頭堿適宜的作用濃度，集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況，Real-Time PCR檢測miR-23a的表達水平，Western blot檢測miR-23a下游靶蛋白IRF1的表達水平。結(jié)果：烏頭堿可降低MGC803細(xì)胞的存活率，且呈濃度及時間依賴性，同時烏頭堿可降低腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力;烏頭堿可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;烏頭堿可下調(diào)miR-23a的表達，上調(diào)其下游靶蛋白IRF1的表達;封閉內(nèi)源性miR-23a后經(jīng)烏頭堿處理，細(xì)胞凋亡水平顯著增加。結(jié)論：烏頭堿可通過調(diào)節(jié)miR-23a/IRF1通路，從而誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖。

【關(guān)鍵詞】?烏頭堿;miR-23a;細(xì)胞凋亡;胃腺癌

【中圖分類號】R285.5?【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）24-0012-06

Abstract：Objective To explore the miRNAs related mechanism of aconitine in inhibiting proliferation of human gastric adenocarcinoma cells MGC803. Methods MGC803 cells treated with aconitine， MTT assay was used to detect cell viability and to determine the suitable concentration of aconitine for follow-up experiments，colony formation assay was used to detect ability ofcell clonogenicity， TUNEL was used to detect numbers of apoptotic cells， Real-time PCR was used to detect expression of miR-23a，Western blot was used to detect the expression of IRF1 targeted by miR-23a. Results Compared with the NC group，the cell viabilitywas significantly down-regulated， which exhibit dose-effect and time-effect relationship， and cell clonogenicity ability was also down-regulated; numbers of apoptotic cells was significantly up-regulated; the expression level of miR-23a was down-regulated， but the expression level of IRF1 protein was up-regulated in the aconitine group; Compared with NC group， MGC803 cells transfected with ASO-23a and then treated with aconitine was significantly up-regulated numbers of apoptotic cells.Conclusion Aconitine induces apoptosis and inhibits the proliferation of human gastric adenocarcinoma cells by regulating the miR-23a/IRF1 pathway.

Keywords：Aconitine; MiR-23a; Apoptosis; Gastric Adenocarcinoma

胃癌是一種在全球范圍內(nèi)預(yù)后差、致死率高的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，大約90%的胃部腫瘤都屬于腺瘤[1]。一般認(rèn)為外科手術(shù)是對其進行根治的唯一療法，同時輔以放化療。然而，由于早期胃癌的診斷率低，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)就是進展期或晚期，錯過最佳的手術(shù)窗口期，增加胃癌的致死率[2]。目前在臨床上主要使用卡培他濱、順鉑、氟尿嘧啶等在內(nèi)的化療藥物進行聯(lián)合治療。但化療藥物副作用明顯，且長期使用會損害機體的多個器官系統(tǒng)[3]。中藥具有良好的抗腫瘤活性，且毒副作用小。生物堿類是中藥有效成分中的重要組成之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種生物活性[4]。烏頭堿（aconitine）是存在于川烏、草烏、附子等藥用植物的一種生物堿。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，烏頭類中藥具有回陽救逆、溫陽散寒等療效;近些年臨床應(yīng)用和實驗研究表明，其在抗腫瘤、強心、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等方面具有特殊的功效。

烏頭堿對包括胃癌在內(nèi)的多種惡心腫瘤都具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及侵襲的作用[5-6]。將烏頭堿注射液稀釋后接種胃癌FC的615純系小鼠，結(jié)果顯示實驗組瘤重抑制率顯著高于對照組[7];王冠庭[8]發(fā)現(xiàn)以烏頭堿注射液治療晚期胃癌患者，3個療程后，患者癥狀改善，梗阻癥狀消失。然而目前烏頭堿在臨床上的應(yīng)用卻受到限制，一方面是由于其使用劑量及毒性;另一方面則是其抗腫瘤作用機制的研究還十分有限。

miR-23a是定位于人19號染色體的一種非編碼微小RNA，與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，被視為一個癌基因[9-11]。利用生物信息學(xué)方法（綜合TargetScan、MirBase兩個網(wǎng)站信息）預(yù)測出IRF1為miR-23a的可能靶基因，且已知報道m(xù)iR-23a在胃腺癌組織中高表達，并通過下調(diào)其下游靶蛋白干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）參與調(diào)節(jié)胃腺癌細(xì)胞的增殖[12-13]，兩者之間的靶定關(guān)系在肝癌細(xì)胞中也同樣存在[14]。而烏頭堿的抑癌作用是否與參與調(diào)節(jié)miR-23a及其通路相關(guān)，這一點仍需進一步研究。本研究在細(xì)胞及分子水平，使用烏頭堿對細(xì)胞進行處理，通過觀察細(xì)胞增殖與凋亡情況，檢測目標(biāo)基因及靶蛋白水平的變化，探討烏頭堿抗腫瘤作用miRNA水平的機制，為臨床上合理應(yīng)用烏頭堿治療胃癌提供相關(guān)的實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?藥物與試劑?烏頭堿（批號BBP03866，云南西力生物有限公司）：取烏頭堿20.3mg，加入1.015mL三氯甲烷，配制成20mg/mL的母液，然后按一定的比例分別稀釋成濃度為0、5、10、20、40、60、80、100μg/mL的稀釋液備用;三氯甲烷（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）;MTT（SIGMA，美國）;DMSO（SIGMA，美國）結(jié)晶紫（SIGMA，美國）; 4%多聚甲醛（北京鼎國，北京）;TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（Roche， 瑞士）;RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO， 美國）;胎牛血清（GIBCO， 美國）;IRF1抗體、GAPDH抗體（天津賽爾生物科技有限公司）;SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa， 日本）;Real-time PCR引物（miR-23a forward： 5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′及miR-23a-3p-Reverse：5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′;陰性對照U6 forward：5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′及U6-Reverse： 5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′）購自昆明品品生物科技有限公司。

1.1.2?細(xì)胞株?胃腺癌細(xì)胞系MGC803購自天津賽爾生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?烏頭堿適宜作用濃度的篩選（MMT法）?將生長狀態(tài)良好的MGC803細(xì)胞接種于96孔板（細(xì)胞數(shù)約8×103個），細(xì)胞完全貼壁后分別更換為濃度梯度稀釋的烏頭堿溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72h，另設(shè)溶劑對照組;分別在0、24、48、72h后，每孔加10μL 濃度為5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;后終止培養(yǎng)并棄掉原培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min;在酶聯(lián)免疫檢測儀上波長為490nm處測出各孔的吸光度值進行細(xì)胞活力檢測。根據(jù)以下公式計算烏頭堿對MGC803細(xì)胞的存活率：（實驗組OD-空白對照OD）/（對照組OD-空白對照OD）]×100%。

1.2.2?集落形成實驗檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力?收集對數(shù)期MGC803細(xì)胞，接種于12孔板中，設(shè)置對照組和實驗組（烏頭堿處理），每孔細(xì)胞數(shù)約150個細(xì)胞，每組3個平行，培養(yǎng)24h后，對照組每孔加入1mL正常培養(yǎng)基，實驗組加入1mL濃度為60μg/mL的烏頭堿稀釋溶液，每3天換液1次，培養(yǎng)14d;后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)每孔大于50個以上的集落數(shù)目，計算集落形成率。

1.2.3?TUNEL檢測細(xì)胞凋亡水平?選取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的MGC803細(xì)胞，消化計數(shù)后接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h，實驗組加入濃度為60μg/mL的烏頭堿溶液1mL，對照組不加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48h。后棄去原培養(yǎng)液，用PBS清洗兩遍，待細(xì)胞自然晾干后進行樣本固定;樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后加入蛋白酶K滅活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒溫箱中避光孵育60min。把處理好的樣本PBS漂洗3次，每次5min;用無菌雙蒸水將1μg/mL DAPI染液儲存液稀釋1000倍，每孔加40μL，室溫避光染色5min。用無菌雙蒸水于室溫洗2次，5min/次。熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光代表細(xì)胞凋亡，藍(lán)色熒光代表生存細(xì)胞。

1.2.4?Real-time?RCR檢測miR-23a的表達水平?收集細(xì)胞樣本加入1mL Trizol裂解，提取細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測量RNA濃度后，將合格的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以得到對應(yīng)的cDNA，miR-23a-RT：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACGGAAAT3′。熒光實時定量PCR反應(yīng)體系：總體積為20μL，包括cDNA模板1μL、上下游引物各1μL、SYBRGREEN 10μL，其余用ddH2O補齊。反應(yīng)條件為94℃ 4min;94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，40個循環(huán)。正向引物序列：5′TGCGGATCACATTGCCAGGGATTTC3′，反向引物序列：5′ CCAGTGCAGGGTCCGAGGT3′。對照組U6正向引物序列：5′TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′，反向引物序列：5′CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′。封閉miR-23a序列，ASO-23a序列為：5′GGAAATCCCTGGCAATGTGAT3′;ASO-NC序列為：5′CAGTACTTTTGTGTAGTACAA3′。

1.2.5?Western blot檢測IRF1蛋白的表達量?按照實驗組與對照組分別收集細(xì)胞，后加入RIPA裂解液對蛋白質(zhì)進行抽提。配置10%的SDS-PAGE凝膠，將處理好的蛋白樣品取適量上樣，恒壓80V電泳2.5h，對目的蛋白進行分離。后轉(zhuǎn)膜并用5%的脫脂奶粉溶液進行封閉，然后一抗4℃結(jié)合過夜，1×TBST侵洗3次后加入二抗，室溫作用1.5h。最后用Western LightningTM Enhanced Chemiluminescence Substrate檢測顯影，將曝光后進行定影處理的膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)進行攝像，分析內(nèi)源性IRF1條帶的亮度值。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，每組實驗結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，統(tǒng)計圖使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪制。所有實驗重復(fù)至少3次，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?烏頭堿抑制胃腺癌細(xì)胞MGC803的增殖?已知烏頭堿（圖1A）具有一定的細(xì)胞毒性[15]，為檢測其對胃腺癌細(xì)胞MGC803增殖的影響，首先將制備的烏頭堿母液（20mg/mL）按一定的濃度梯度進行稀釋（0、5、10、20、40、60、80、100μg/mL），利用MMT實驗對不同濃度的烏頭堿溶液對細(xì)胞活性的影響進行檢測，并計算存活率（圖1A）。如圖1B所示，烏頭堿對MGC803細(xì)胞體外增殖有著明顯的抑制作用，并且隨著作用濃度和作用時間的延長，其抑制作用增強，具有濃度和時間的依賴性。烏頭堿作用MGC803細(xì)胞48h后應(yīng)用GraphPad Prism 5.0計算出的IC50值為（37.76±1.65）μg/mL，后續(xù)實驗中選擇40μg/mL作為實驗組作用的藥物濃度。為進一步證實烏頭堿抑制癌細(xì)胞增殖的作用，集落形成實驗顯示，與對照組比較實驗組細(xì)胞集落形成能力下降（圖1B），且具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2?烏頭堿可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制胃腺癌細(xì)胞增殖細(xì)胞?凋亡是細(xì)胞程序性死亡多種形式中研究最為深入的一種。細(xì)胞凋亡作為一種重要的細(xì)胞死亡形式，當(dāng)其發(fā)生失調(diào)時，可打破細(xì)胞生長與死亡之間的平衡，是腫瘤發(fā)生的重要機制之一[16]。為了明確烏頭堿在結(jié)果2.1中所表現(xiàn)出的抑癌作用是否與參與細(xì)胞凋亡有關(guān)，利用TUNEL實驗進行檢測。如圖2A所示，烏頭堿處理組與對照組相比，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，凋亡指數(shù)顯示兩組存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（圖2B）。

2.3?烏頭堿下調(diào)內(nèi)源性miR-23a的表達間接上調(diào)其下游靶基因IRF1的水平?大量研究證實miR-23a在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演癌基因的角色。在胃腺癌細(xì)胞MGC803中，miR-23a可通過下調(diào)IRF1抑制細(xì)胞凋亡[13]。為了研究烏頭堿誘導(dǎo)MGC803發(fā)生細(xì)胞凋亡與miR-23a及其下游靶基因的關(guān)系，設(shè)置實驗組與對照組，通過Real-time PCR檢測烏頭堿對內(nèi)源性miR-23a表達的影響，以及利用Western blot檢測烏頭堿間接對miR-23a下游靶基因IRF1表達的影響。結(jié)果如圖3顯示，經(jīng)烏頭堿處理后，內(nèi)源性miR-23表達下調(diào)（圖3A），同時IRF1表達上調(diào)（圖3B，3C）。這說明烏頭堿通可過參與調(diào)節(jié)miR-23a抑制細(xì)胞凋亡。

2.4?封閉內(nèi)源性miR-23a后經(jīng)烏頭堿處理細(xì)胞凋亡加強?為了進一步明確烏頭堿誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)miR-23a的關(guān)系，通過反義miR-23a寡聚核苷酸封閉內(nèi)源性miR-23a，同時設(shè)置對照組進行實驗。首先，對反義miR-23a寡聚核苷酸的有效性進行檢測，同事發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ASO-23a后再經(jīng)烏頭堿處理，miR-23a的表達水平與對照組相比進一步降低（圖4A）。將對照組（ASO-NC）及實驗組（ASO-23a）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，5% CO2 孵箱37℃培養(yǎng)6h后對照組及實驗組加入烏頭堿稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h利用TUNEL對細(xì)胞凋亡水平進行檢測。結(jié)果如圖4B、4C所示，首先不加藥時，轉(zhuǎn)染ASO-23a與轉(zhuǎn)染ASO-NC相比細(xì)胞凋亡水平升高，反向驗證miR-23a可抑制細(xì)胞凋亡;而封閉內(nèi)源性miR-23a后，加藥組與非加藥組相比，細(xì)胞凋亡明顯加強說明加藥后內(nèi)源性miR-23a表達的進一步下降促進細(xì)胞凋亡的進一步發(fā)生，同時也提示烏頭堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與調(diào)節(jié)miR-23a以外的其他活動相關(guān)。

3?討論

烏頭類中藥具有很高的藥用價值，其活性成分中的一大類為烏頭類生物堿，烏頭堿即為其中一種。以近些年備受關(guān)注的miRNA作為切入點，研究中藥活性成分的作用機制具有重要意義。筆者從miRNA水平揭示了烏頭堿抑制胃腺癌細(xì)胞增殖的新機制，即烏頭堿可通過下調(diào)癌基因miR-23a的水平，間接上調(diào)其下游靶基因IRF1的表達，從而誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞MGC803發(fā)生凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

已知報道m(xù)iR-23a及其下游多個靶基因均可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11，17-18]，那么烏頭堿抗胃癌作用的發(fā)揮除本文研究的IRF1以外是否與調(diào)節(jié)其他下游蛋白相關(guān)，從而實現(xiàn)一種網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控，這一點仍需進一步研究。值得注意的是，IRF1還可激活caspase1、caspase3、caspase7、以及caspase8[19-20]，而其他程序性細(xì)胞死亡形式也存在caspase依賴途徑，同時隨著近些年研究的深入，多種程序性細(xì)胞死亡形式之間的聯(lián)系被逐漸揭示，比如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞鐵死亡等均可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時發(fā)生機制也有交叉[21]。有報道指出烏頭堿也可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬[22]，提示對中藥活性成分作用機制的研究可以從不同細(xì)胞死亡形式入手。另外，烏頭堿還具有抗感染及抗炎作用，幽門螺旋桿菌的感染與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切[23-24]，因此烏頭堿抑制胃癌的作用是否與抗感染及抗炎作用相關(guān)也值得進一步思考。

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（收稿日期：2020-07-15?編輯：程鵬飛）