周晶 董笑克 馬青科 金香蘭 張志辰

阿爾茲海默癥(alzheimer’s disease，AD)是一種在全球范圍內(nèi)常見的神經(jīng)退行性疾病，患者表現(xiàn)為記憶缺失、語言、定向力障礙、幻覺等，患者及家屬的生活質(zhì)量嚴(yán)重降低。目前，尚無有效的藥物預(yù)防或逆轉(zhuǎn)AD的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白-β(amyloid-beta ，Aβ)激活絲氨酸蛋白激酶3β(serine protein kinase 3 β，GSK3β)，上調(diào)的微管相關(guān)蛋白Tau蛋白過度磷酸化，是AD發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中草藥及其提取物對AD的治療具有一定的優(yōu)勢，中藥抗AD有效物質(zhì)的篩選及其機(jī)制研究是AD治療研究的重點(diǎn)。中藥黃連提取物黃連素具有抗炎、抗氧化等作用，可有效地改善大鼠認(rèn)知缺陷和記憶力。為了進(jìn)一步探究黃連素治療AD的機(jī)制，本研究旨在通過阿爾茲海默癥大鼠模型，探究不同劑量黃連素對大鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能的影響，并通過對AD發(fā)病的關(guān)鍵蛋白GSK3β、p-Tau表達(dá)量的檢測，闡釋黃連素治療AD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性wistar大鼠62只，6周齡，體重(220±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證編號：SYXK(京)：2019-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)級別為SPF級，5只/籠，保證正常光照節(jié)律、溫度適度、環(huán)境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物及試劑

鹽酸小檗堿(黃連素)，成都錦華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：180613；Aβ25-35，美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：053M4804V，注射前用生理鹽水將Aβ25-35配制為10 μg/μL的溶液，在37℃ 孵育1周；重組Anti-GSK3 beta抗體(Y174)，abcam公司，貨號：ab32391；重組Anti-Tau (phospho S396)抗體，abcam公司，貨號：ab109390。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

WMT-100 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；大鼠數(shù)顯腦立體定位儀，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，規(guī)格：ZS-B/S；微量注射針Trajan Scientific and Medical(SGE)，規(guī)格：10 μL；實(shí)驗(yàn)動物飲水機(jī)(MN-LM500J)，北京木牛流馬凈化工程技術(shù)有限公司；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)，美國BIO-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司。

1.4 造模與給藥方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組，黃連素低劑量組、黃連素中劑量組、黃連素高劑量組，假手術(shù)組10只，其余每組各13只。假手術(shù)組大鼠注射生理鹽水，其余各組大鼠腹腔注射D-半乳糖，100 mg/kg，每日1次，共注射6周。連續(xù)注射D-半乳糖2周后，黃連素低、中、高劑量組分別給予黃連素50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg灌胃，其余大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，干預(yù)4周。注射第3周時(shí)，1%戊巴比妥鈉腹腔注射40 mg/kg麻醉大鼠。在大鼠腦立體定位儀下，自顱頂前囟向后4.4 mm、旁開 2.2 mm，硬腦膜下3.0 mm，微量注射泵緩慢注射Aβ25-3510 μg于一側(cè)海馬，留針5分鐘，同樣方法將等劑量Aβ25-35注入對側(cè)海馬[1]。假手術(shù)組大鼠同方法注射等量生理鹽水。注射后大鼠傷口縫合，術(shù)區(qū)消毒。術(shù)后每天碘伏傷口消毒，連續(xù)3天。造模7天后進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測試，以第5天假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期均值為參考值，若各造模大鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比值>20%則表示造模成功[2]。模型組和黃連素低、中、高劑量組各有3只造模失敗，剔除。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 大鼠藥物干預(yù)4周后，進(jìn)行為期7天的Morris水迷宮行為學(xué)檢測，其中第1～6天為定位航行實(shí)驗(yàn)，第7天為空間探索實(shí)驗(yàn)。第1～2天進(jìn)行訓(xùn)練，每日上午、下午(間隔兩小時(shí)以上)固定時(shí)間訓(xùn)練，記錄大鼠找到平臺所需時(shí)間，即逃避潛伏期，并記錄大鼠線路圖、總路程等。若大鼠90秒內(nèi)不能找到平臺，將其引導(dǎo)至平臺，在平臺停留15秒后放回籠中，記錄該大鼠的逃避潛伏期為 90秒。第3～6天，在固定時(shí)間將大鼠背對平臺分別從對側(cè)象限及相鄰象限放入池中，每天兩次，記錄逃避潛伏期。第7天，撤掉平臺，將大鼠從對側(cè)象限放入水池，記錄90秒內(nèi)大鼠穿越原平臺位置次數(shù)、中心區(qū)域值、中環(huán)區(qū)域值等。

1.5.2 海馬組織GSK3β及p-Tau蛋白表達(dá) 水迷宮結(jié)束后，各組大鼠麻醉，取雙側(cè)新鮮海馬迅速凍存于液氮中，進(jìn)行Western Bolt檢測。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組阿爾茲海默癥大鼠死亡情況

術(shù)后模型組、黃連素低、高劑量組各死亡1只，死亡原因?yàn)槭中g(shù)損傷。

2.2 各組阿爾茲海默癥大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 游泳路徑圖 對比各組大鼠游泳路徑線路圖(見圖2)，假手術(shù)組以趨向式、直線式為主，模型組以隨機(jī)式、邊緣式為主，黃連素低劑量組以隨機(jī)式、趨向式為主，黃連素中劑量組以趨向式、隨機(jī)式為主，黃連素高劑量組以趨向式、直線式為主。

2.2.2 定位航行實(shí)驗(yàn) 取第6天各組大鼠兩次逃避潛伏期、總路程平均值進(jìn)行分析。與假手術(shù)組相比，模型組、黃連素低中劑量組逃避潛伏期、總路程顯著增加(P<0.01)，與模型組相比，黃連素高劑量組逃避潛伏期、總路程顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組阿爾茲海默癥大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期、 總路程對比

注： 與假手術(shù)相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，

dP<0.01。

2.2.3 空間探索實(shí)驗(yàn) 各組大鼠第一次穿越目標(biāo)區(qū)域時(shí)間對比：與假手術(shù)組相比，其余四組第一次穿越目標(biāo)區(qū)域時(shí)間均顯著增高(P<0.01)，與模型組相比，黃連素中、高劑量組第一次穿越目標(biāo)區(qū)域時(shí)間降低(P<0.05，P<0.01)。各組大鼠中心區(qū)域值無顯著差異(P>0.05)。各組大鼠中環(huán)區(qū)域?qū)Ρ龋耗Ｐ徒M、黃連素中高劑量組中環(huán)區(qū)域顯著低于假手術(shù)組(P<0.01，P<0.05)，與模型組相比，低劑量組中環(huán)區(qū)域數(shù)值增加(P<0.05)。各組大鼠穿越目標(biāo)區(qū)域次數(shù)對比：模型組、黃連素低劑量組穿越次數(shù)顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)，與模型組相比，黃連素中、 高劑量組穿越次數(shù)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。

2.3 各組阿爾茲海默癥大鼠海馬組織GSK3β、p-Tau蛋白表達(dá)

各組大鼠海馬組織GSK3β蛋白表達(dá)：與假手術(shù)組相比，其余各組GSK3β蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，黃連素中、高劑量組GSK3β蛋白表達(dá)下降(P<0.05，P<0.01)。各組大鼠海馬組織p-Tau蛋白表達(dá)：與假手術(shù)組相比，模型組、黃連素低、中劑量組p-Tau蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，高劑量組p-Tau蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。見圖3、表3。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

注：A 假手術(shù)組；B模型組；C 黃連素低劑量組；D 黃連素中劑量組；E 黃連素高劑量組。

圖2各組大鼠游泳軌跡圖

表2 各組阿爾茲海默癥大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)分析

注： 與假手術(shù)相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01。

表3 各組阿爾茲海默癥大鼠GSK3β、p-Tau蛋白 表達(dá)結(jié)果比較

注： 與假手術(shù)相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，

dP<0.01。

注：A假手術(shù)組；B模型組；C黃連素低劑量組；D黃連素中劑量組；E黃連素高劑量組。

圖3各組阿爾茲海默癥大鼠腦組織GSK3β、p-Tau蛋白表達(dá)

3 結(jié)論

阿爾茲海默癥是全球癡呆最常見的類型，約占癡呆癥主要原因的70%[3]，全球約有4000萬人患有AD，并且AD的患病率逐年上漲[4]。AD患者自身承受著巨大的痛苦，此外，對于家庭和社會都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD典型病理改變?yōu)槟X組織中大量Aβ斑塊的積累[5]，以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofilament tangle，NFT)。目前認(rèn)為其產(chǎn)生機(jī)制主要為Aβ抑制AKT的磷酸化[6]，從而減少GSK-3磷酸化失活，增加活性的GSK-3，促進(jìn)Tau過度磷酸化，從微管脫離，導(dǎo)致微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，最終形成AD的標(biāo)志性物質(zhì)NFT[7]。基于此，學(xué)者提出GSK3是Aβ和tau橋梁[8]。針對于Aβ研發(fā)的靶向藥物都以失敗告終，研究發(fā)現(xiàn)，影響AD進(jìn)展的主要因素是Tau而不是Aβ[3]。因此，尋找選擇性抑制GSK3的藥物有望有效延緩AD進(jìn)展，是目前AD治療的熱點(diǎn)。

阿爾茲海默癥屬中醫(yī)“呆病”“癡呆”“善忘”等范疇，多認(rèn)為其與痰濁、瘀血、腎虛、抑郁及情志因素密切相關(guān)。部分學(xué)者提出癡呆與“熱”“毒”有關(guān)，并用清熱解毒法治療癡呆取得了良好的效果[9-10]。大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了黃連解毒湯等清熱解毒方劑及中藥對癡呆的療效[11-12]。此外，對中醫(yī)治療健忘或癡呆的中藥方劑進(jìn)行用藥規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)重補(bǔ)虛藥、安神藥、清熱藥，其中清熱藥的核心藥物為甘草、生地及黃連[13]。

黃連素是中藥黃連的主要有效成分之一，除抗菌、抗炎、降糖、降脂、抗氧化、抗抑郁等作用之外，研究發(fā)現(xiàn)黃連素還有治療阿爾茲海默癥的潛力[14]。對記憶缺陷的動物，黃連素具有顯著的改善大/小鼠記憶力的作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以減輕突觸損傷[16]，通過部分抑制凋亡級聯(lián)、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激來部分改善LPS誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知缺陷[17]。本研究中，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三種劑量的黃連素均能不同程度地改善阿爾茲海默癥大鼠逃避潛伏期、中環(huán)區(qū)域比例、游泳距離等指標(biāo)，其療效與劑量呈正相關(guān)，150 mg/kg黃連素對大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力改善更佳。對GSK3β、p-Tau蛋白表達(dá)的結(jié)果與行為學(xué)檢測結(jié)果一致，150 mg/kg黃連素對GSK3β、p-Tau蛋白表達(dá)具有最強(qiáng)的下調(diào)作用。

綜上所述，黃連素具有顯著的改善阿爾茲海默癥模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的作用，療效與用量成正相關(guān)，其機(jī)制與黃連素降低活性GSK3β蛋白含量，抑制Tau磷酸化相關(guān)。