劉海峰，趙永厚，高 源

0引言

糖尿病的發(fā)生是在遺傳的基礎(chǔ)上，糖尿病患者體內(nèi)長期高血糖狀態(tài)導(dǎo)致多元醇代謝通路異常，蛋白激酶C激活，糖基化血紅蛋白和多元醇代謝產(chǎn)物因機(jī)體代謝障礙而逐漸堆積，氧化應(yīng)激增強(qiáng)、細(xì)胞因子失衡等多因素共同參與、互相作用，破壞了視網(wǎng)膜生理屏障并啟動了氧化應(yīng)激損傷[1-2]。燈盞花素(scutellarin)主要活性成分是燈盞乙素，具有抑制炎癥反應(yīng)、減輕組織水腫、改善微循環(huán)、抗氧化、擴(kuò)張血管的作用[3]。本研究通過構(gòu)建高糖條件下視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞氧化損傷模型，探討燈盞花素對RPE細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料燈盞花素(美國Sigma公司，純度>99%)，人RPE細(xì)胞(美國ATCC公司)，DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(武漢博士德生物工程有限公司)，CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)， H2DCFDA熒光探針(江蘇凱基生物公司)，Hoechst 33258染色試劑盒(北京百奧萊博公司)，Bcl-2和Bax抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1 RPE細(xì)胞的培養(yǎng)選取加入青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12作為培養(yǎng)基，37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行RPE細(xì)胞培養(yǎng)(本實(shí)驗(yàn)中的RPE細(xì)胞為傳代第6代)。

1.2.2 RPE細(xì)胞分組依據(jù)燈盞花素濃度不同，分為四組：對照組RPE細(xì)胞以正常培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)孵育36h；高糖組RPE細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)葡萄糖濃度為30mmol/L，細(xì)胞孵育時間為12h[4]；燈盞花素低濃度組先以1μmol/L燈盞花素孵育細(xì)胞24h，PBS沖洗細(xì)胞3次，以換液方式在葡萄糖濃度為30mmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h；燈盞花素高濃度組先以10μmol/L燈盞花素孵育細(xì)胞24h，PBS沖洗細(xì)胞3次，以換液方式在葡萄糖濃度為30mmol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察RPE細(xì)胞的遷移性以1×105/mL的密度將RPE細(xì)胞接種到6孔板，按上述方法處理細(xì)胞并分組，待細(xì)胞貼壁融合后24h，用2μL加樣槍頭比著直尺在培養(yǎng)板中間垂直劃痕，PBS沖洗劃下的細(xì)胞，加入無血清的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，在48h時間點(diǎn)進(jìn)行取樣、拍照記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8法測定細(xì)胞增殖RPE細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每孔200μL，細(xì)胞密度為1×105個/mL，按實(shí)驗(yàn)分組處理，棄去原有培養(yǎng)液，將已配制含10% CCK-8的培養(yǎng)基以換液的形式加入，接種后的96孔板37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，用480nm吸光度進(jìn)行檢測。

1.2.5流式細(xì)胞技術(shù)檢測RPE細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)用不含EDTA的胰酶消化RPE細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液，1 000r/min離心5min并收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞并用100μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin-V和10μL PI，輕輕混勻，避光反應(yīng)10min后再次加入100μL緩沖液，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min后PBS充分沖洗固定液，加入2μL Hoechst 33258染色液，避光反應(yīng)10min后PBS充分沖洗，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western Blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞并提取總蛋白，10 000r/min離心10min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉4℃封閉2h，加羊抗兔多克隆一抗(稀釋濃度1∶1 000 )過夜，室溫下孵育鼠抗羊二抗(稀釋濃度1∶2 000)1h，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像，觀察Bcl-2和Bax的Western Blot條帶變化。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測高糖下RPE細(xì)胞的遷移性四組RPE細(xì)胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。拍照記錄可見，對照組RPE細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，48h后劃痕仍清晰可見；高糖組培養(yǎng)的RPE細(xì)胞劃痕在48h時基本消失，且細(xì)胞狀態(tài)不佳，死亡和變形細(xì)胞增加，高糖組RPE細(xì)胞遷移率與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；燈盞花素低濃度組和燈盞花素高濃度組RPE細(xì)胞形態(tài)較高糖組改善(圖1)，細(xì)胞遷移率較高糖組增加，與高糖組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中燈盞花素高濃度組RPE細(xì)胞遷移率與燈盞花素低濃度組RPE細(xì)胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2燈盞花素對RPE細(xì)胞活力的影響四組RPE細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。對照組RPE細(xì)胞存活率與高糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1、10μmol/L燈盞花素孵育RPE細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%，與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；燈盞花素高濃度組RPE細(xì)胞存活率與燈盞花素低濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 RPE細(xì)胞內(nèi)ROS的變化以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，相對熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，可測定活細(xì)胞ROS的相對表達(dá)量。檢測結(jié)果顯示，四組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。對照組ROS主峰位于基線左側(cè)，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)較低；高糖組ROS主峰向基線右側(cè)移位，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增加；1、10μmol/L燈盞花素干預(yù)后，RPE細(xì)胞內(nèi)ROS主峰逐漸向基線左側(cè)移位，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)逐漸降低(圖2)；燈盞花素高濃度組RPE細(xì)胞內(nèi)ROS相對表達(dá)量與燈盞花素低濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1RPE細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(×200)A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

圖2流式細(xì)胞技術(shù)檢測RPE細(xì)胞內(nèi)ROS改變A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

圖3燈盞花素對高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡的影響(箭頭示凋亡細(xì)胞)(×200)A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

組別細(xì)胞遷移率(%)細(xì)胞存活率(%)ROS熒光強(qiáng)度細(xì)胞凋亡率(%)Bcl-2Bax對照組103.03±4.11102.44±5.641.12±1.321.60±0.990.79±0.160.69±0.12高糖組44.21±4.67a40.63±4.72a100.55±3.44a55.43±7.67a0.13±0.10a1.03±0.13a燈盞花素低濃度組59.50±4.03a,c61.06±5.59a,c76.88±6.62a,c36.34±6.03a,c0.16±0.13a0.95±0.15a燈盞花素高濃度組71.84±3.39a,c,e79.81±7.04a,c,e33.26±4.11a,c,e21.08±5.49a,c,e0.55±0.16a,c,e0.73±0.09c F102.3097.5786.99105.32100.5972.55P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs高糖組；eP<0.05vs燈盞花素低濃度組。

2.4燈盞花素對RPE細(xì)胞凋亡的影響四組RPE細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。在Hoechst 33258染色劑作用下，活細(xì)胞細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)致密濃染的顆粒狀高熒光。熒光顯微鏡下，對照組背景熒光暗黑色，細(xì)胞核均勻染色，未見明顯凋亡細(xì)胞；高糖組部分細(xì)胞核呈致密濃染的亮藍(lán)色高熒光；1、10μmol/L燈盞花素處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(圖3)，燈盞花素高濃度組細(xì)胞凋亡率與燈盞花素低濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平檢測四組RPE細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖4)。Bcl-2蛋白在高糖組中的表達(dá)明顯降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低、高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高，其中高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達(dá)與高糖組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；燈盞花素高濃度組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量與燈盞花素低濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bax蛋白在高糖組中的表達(dá)明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；燈盞花素干預(yù)可降低Bax蛋白的表達(dá)，其中高劑量燈盞花素組Bax蛋白表達(dá)的相對表達(dá)量與高糖組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4燈盞花素對RPE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

3討論

隨著糖尿病的進(jìn)展，其并發(fā)癥開始出現(xiàn)，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病足潰瘍、心血管疾病等[5]。其中，糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變是慢性高血糖引起的主要微血管并發(fā)癥，其發(fā)生原因與晚期氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)、促炎微環(huán)境的建立以及糖基化終產(chǎn)物增多有關(guān)[6-7]。

有研究顯示，燈盞花素在治療糖尿病腎病和周圍神經(jīng)病變方面均有療效，其作用機(jī)制與降低組織氧化應(yīng)激水平、抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)有關(guān)[8-9]。在眼部，有學(xué)者采用霧化燈盞花素注射液方法治療糖尿病視網(wǎng)膜病變，發(fā)現(xiàn)該方法具有延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程、改善患者視功能和提高生活質(zhì)量的作用。此外，燈盞花素注射液在治療中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞方面均有臨床療效[10-11]。關(guān)于燈盞花素對RPE細(xì)胞保護(hù)作用的研究并不多見，國內(nèi)學(xué)者王競男等[12]通過建立大鼠糖尿病模型，觀察燈盞花素對大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果顯示燈盞花素可以有效降低VEGF表達(dá)，從而推測燈盞花素可以延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變病程。

有學(xué)者對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶表達(dá)明顯下調(diào)，而超氧化物明顯增加，說明糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激程度明顯增加[13-14]。本實(shí)驗(yàn)使用30mmol/L濃度的葡萄糖建立了RPE細(xì)胞高糖氧化應(yīng)激模型，結(jié)果顯示30mmol/L濃度的葡萄糖引起RPE細(xì)胞活力降低，給予1、10μmol/L燈盞花素作用后，細(xì)胞活力增加。

H2DCFDA是一種可滲透細(xì)胞的熒光探針，用于檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS生成。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察高糖對RPE細(xì)胞的氧化損傷程度，結(jié)果顯示高糖對RPE細(xì)胞氧化損傷有明顯刺激作用，燈盞花素有效抑制了RPE細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

Hoechst 33258染色劑能與細(xì)胞核DNA結(jié)合并呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。凋亡的細(xì)胞核濃染，熒光增強(qiáng)，呈致密顆粒和(或)塊狀高熒光；非凋亡細(xì)胞呈暗藍(lán)色低熒光。本實(shí)驗(yàn)中，高糖組中亮藍(lán)色熒光明顯增多，證實(shí)高糖可以誘發(fā)RPE細(xì)胞凋亡，燈盞花素低劑量組和燈盞花素高劑量組中凋亡細(xì)胞比例逐漸降低。

Bcl-2在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)中起重要作用，是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用[15]。Bax表達(dá)水平的高低直接反映細(xì)胞凋亡程度，Western blot結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增加，提示高糖誘導(dǎo)了RPE細(xì)胞凋亡，燈盞花素通過改變Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，燈盞花素能夠有效抑制高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療靶點(diǎn)研究提供了理論支持。