陶詩詩 陳 亮

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，因其術(shù)后復(fù)發(fā)和惡性轉(zhuǎn)移率高已成為危害女性健康的最主要的疾病之一[1]。多方面研究表明，全球范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率迅速增加。就中國而言，每年新增患者數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的 12.2% 和 9.6%[2]。經(jīng)過不斷研究，目前已經(jīng)篩選出許多腫瘤相關(guān)基因，并對其生物功能進(jìn)行了深入探索，這使得人們對乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有了更多了解[3]。盡管早期乳腺癌術(shù)后 5 年生存率可達(dá) 80%[2]，但術(shù)后的遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移使乳腺癌總生存率并不樂觀。隨著全基因組測序技術(shù)的成熟、精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出以及腫瘤靶向藥物的應(yīng)用，臨床上乳腺癌的診斷和治療都取得了一定進(jìn)展。靶向治療已逐步替代以手術(shù)、化療、放療為主的治療方案，同時原來的經(jīng)驗治療也正朝個體化治療方向發(fā)展。因此，進(jìn)一步挖掘乳腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移過程中的標(biāo)志性癌基因，并揭示其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制是這種新治療模式發(fā)展的關(guān)鍵所在，這將為完善乳腺癌基因靶點(diǎn)治療策略奠定基礎(chǔ)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是維持細(xì)胞正常功能的重要細(xì)胞器，人體 1/3 蛋白質(zhì)都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的，同時它也是蛋白質(zhì)修飾和運(yùn)輸?shù)闹饕獔鏊鵞4-5]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到缺氧或營養(yǎng)缺失等某些刺激時，會發(fā)生功能紊亂，從而導(dǎo)致蛋白錯誤折疊，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會啟動一系列信號通路，其中未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)是被激活的主要調(diào)控機(jī)制之一。它通過促進(jìn)錯誤折疊蛋白快速降解，反饋調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，在一定程度上減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并逐漸恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[7-8]。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)對于維持細(xì)胞的正常生理功能至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，雖然實體腫瘤通常處于長期慢性缺血、缺氧等應(yīng)激微環(huán)境中，但卻能正常存活和增殖。這是由于大部分腫瘤細(xì)胞已進(jìn)化出應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的更強(qiáng)能力，它們通過加速細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白的降解來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)從而促進(jìn)自身存活[9]。

TRIM(Tripartite Motif Family Protein)家族蛋白又被稱為三基序蛋白，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 TRIM 家族蛋白質(zhì)有 70 多種。該家族成員的 N 端都有一個保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，使得大多數(shù) TRIM 家族蛋白具有 E3 泛素連接酶活性，因此它們主要通過調(diào)控目的蛋白降解發(fā)揮功能[10-11]。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時會產(chǎn)生大量錯誤折疊蛋白，因此推測 TRIM 家族蛋白很可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過降解這些錯誤折疊蛋白發(fā)揮其調(diào)控作用，從而影響細(xì)胞存活。此外，許多研究表明 TRIM 家族蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如 TRIM33 可降解細(xì)胞核中β-catenin 蛋白達(dá)到抑癌效果[12]；TRIM24 通過激活癌基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)前列腺癌發(fā)展[13]；TRIM37 在乳腺癌中通過參與單泛素化過程調(diào)控組蛋白表達(dá)發(fā)揮功能[14]。本文作者團(tuán)隊的研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，TRIM 家族蛋白中的 TRIM11 能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中的錯誤折疊蛋白和聚集體降解，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。據(jù)此進(jìn)一步推測在腫瘤細(xì)胞中，TRIM 家族蛋白可能通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來影響細(xì)胞的存活，最終實現(xiàn)調(diào)控腫瘤生長的目的。但目前關(guān)于 TRIM 家族蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的作用幾乎未知，僅有一次關(guān)于TRIM13 能夠定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(Endoplasmic Reticulum Associated Protein Degradation，ERAD)過程的報道[17]，而該蛋白如何發(fā)揮功能的作用機(jī)制尚未有相應(yīng)研究。

本文作者團(tuán)隊就此對 TRIM 家族蛋白進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)變化篩選發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TRIM25 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時表達(dá)水平顯著上調(diào)，因此將 TRIM25 鎖定為研究目標(biāo)，并推測TRIM25 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，擬探究敲低 TRIM25 對乳腺癌細(xì)胞的影響。TRIM25也叫雌激素受體指蛋白(Estrogen-Responsive Finger Protein，EFP)，它在細(xì)胞中的表達(dá)受雌激素調(diào)控，并參與雌激素相關(guān)腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程。統(tǒng)計表明，TRIM25 的高表達(dá)與乳腺癌不良預(yù)后密切相關(guān)[18-20]。因此，本研究旨在通過研究TRIM25 對乳腺癌細(xì)胞 MCF7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程的影響并分析其與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

人源乳腺細(xì)胞 MCF 10A、MCF7、MDAMB-231 均購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)；二甲基亞砜(DMSO)、霍亂毒素(Cholera Toxin，CTX)、毒胡蘿卜素(Thapsigargin，TG)和衣霉素(Tunicamycin，TM)均購自美國 Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液均購自美國 Hyclone 公司；胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國 Gibco 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基和 MEGM SingleQuots? 試劑盒購自瑞士 Lonza 公司；馬血清購自美國 Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細(xì)胞裂解液 RIPA 購自上海碧云天生物技術(shù)公司；蛋白酶抑制劑苯甲基硫酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF)購自上海羅氏制藥有限公司；磷酸酶抑制劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen life 公司；TRIM25抗體、ER stress antibody kit 均購自美國 CST(Cell Signaling Technology)公司；β-tubulin、HRP antimouse 和 HRP anti-rabbit 抗體均購自 Proteintech中國公司；FITC 凋亡檢測試劑盒購自美國BD(Becton，Dickinson and Company)公司。ECL化學(xué)發(fā)光儀(GE，Amersham Imager AI600)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Scientific 公司)；細(xì)胞操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本實驗選用 MCF 10A、MCF7、MDAMB-231、293T 細(xì)胞開展實驗。其中，MCF7 10A 用含 5% 馬血清、MEGM SingleQuots? 試劑以及 100 ng/mL 霍亂毒素的 DMEM/F12 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；其余細(xì)胞均用含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 DMEM 高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2。

2.2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時 TRIM25 表達(dá)量的檢測

為研究 TRIM25 蛋白在乳腺癌細(xì)胞 MCF7 處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時的表達(dá)變化情況，分別從 mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測。首先，將 MCF7 細(xì)胞以60% 的密度接種于 6 孔板中，培養(yǎng)過夜后，分別替換為含 DMSO、5 μg/mL TM、1 μmol TG 的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng) 6 h。然后，棄去培養(yǎng)液，加適量磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution，PBS)洗去殘余培養(yǎng)液，隨后每孔加 1 mL Trizol，室溫放置 5 min，使細(xì)胞充分裂解后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至 RNAse-free 的 1.5 mL 離心管提取 RNA。另外，設(shè)置同上處理的 3 個孔，加DMSO、TM 及 TG 后繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，棄去培養(yǎng)液，加適量的 PBS 洗去殘余培養(yǎng)基，之后每孔加 500 μL PBS，小心將細(xì)胞刮下并將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管中，提取蛋白。最后，分別采用實時熒光定量 PCR 和蛋白免疫印跡檢測各組 TRIM25 表達(dá)量。

2.2.3 敲低 TRIM25 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及 UPR 信號通路影響的檢測

(1)穩(wěn)定敲低 TRIM25 的 MCF7 細(xì)胞系構(gòu)建

本實驗使用 PLKO.1、VSVG、DR8.91 慢病毒體系進(jìn)行基因敲低。首先，設(shè)計 TRIM25 的短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)，并將shRNA 插入表達(dá)載體 PLKO.1 以構(gòu)建 PLKO.1-shRNA 重組質(zhì)粒。然后，包裝慢病毒，將 293T細(xì)胞以 60% 密度接種于 10 cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h 后，質(zhì)粒 PKOL.1/PLKO.1-shRNA、VSVG、DR8.91 按質(zhì)量比為 9∶1∶10 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，培養(yǎng) 18 h 更換成 7 mL 含 30% 血清和 1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng) 24 h(此過程大量病毒將被分泌到培養(yǎng)基中)。最后，收集培養(yǎng)液以1 250 r/min 在 4 ℃ 下離心 5 min，上清液使用45 μm 濾膜過濾收集濾液至無菌儲存管中。至此病毒液收獲完成，可繼續(xù)換液收病毒 1～2 次。

接下來，用上述包裝好的病毒感染 MCF7細(xì)胞，并用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。具體地，先將 MCF7 細(xì)胞以 60% 密度接種于 6 孔板中，培養(yǎng)過夜，棄培養(yǎng)液，每孔加入 1 mL 培養(yǎng)基、1 mL 病毒液、8 μg/mL polyberen，感染 24 h。然后，換成含 1.5 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每天換液，連續(xù)篩選 4 天(此過程成功感染的細(xì)胞將會存活)，再換成含 0.015 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)存活細(xì)胞。最后，通過實時熒光定量 PCR和蛋白免疫印跡分析該細(xì)胞系中 TRIM25 表達(dá)情況。同時，將經(jīng)驗證的正常表達(dá) TRIM25 對照組(sh Negative Control，shNC)和穩(wěn)定敲低TRIM25(shTRIM25-1、shTRIM25-2)的 MCF7 細(xì)胞系繼續(xù)培養(yǎng)，便可用于后續(xù)實驗。

(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游基因表達(dá)及 UPR 信號通路的檢測

分別從上述構(gòu)建的 MCF7 細(xì)胞系中提取RNA 和蛋白質(zhì)，在 mRNA 水平檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況及 UPR 信號通路下游基因表達(dá)，并在蛋白質(zhì)水平檢測 UPR 信號通路中的關(guān)鍵蛋白。比較shNC、shTRIM25-1、shTRIM25-2 中各基因及蛋白的表達(dá)變化，并分析 TRIM25 敲低對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和 UPR 信號通路的影響。

2.2.4 細(xì)胞凋亡檢測

為研究 MCF7 細(xì)胞中敲低 TRIM25 對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，將 shNC、shTRIM25-1、shTRIM25-2 以 60% 的密度接種于12 孔板中，培養(yǎng)過夜后分別替換為含 DMSO、5 μg/mL TM、1 μmol TG 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。隨后收集細(xì)胞，按 FITC 凋亡檢測試劑盒說明書操作，同時設(shè)置 3 個補(bǔ)償實驗組：空白對照(不染)、50 μmol H2O2處理 12 h(單染 FITC)、65 ℃ 水浴 20 min(單染 PI)，通過流式細(xì)胞分析儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2.2.5 不同乳腺細(xì)胞系中 TRIM25 表達(dá)量的檢測

分別提取 MCF 10A、MCF7、MDA-MB-231細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過蛋白免疫印跡檢測各細(xì)胞系中TRIM25的蛋白表達(dá)水平。

2.2.6 TRIM25 與乳腺癌患者生存期相關(guān)性的分析

通過在線數(shù)據(jù)庫 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)查詢正常乳腺組織和原位乳腺癌組織樣本中TRIM25的蛋白量表達(dá)差異；隨后通過在線分析數(shù)據(jù)庫 SurvExpress((http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp)查詢?nèi)橄侔┗颊叩纳嫫谂c TRIM25表達(dá)量的關(guān)系。進(jìn)一步探討 TRIM25 表達(dá)水平的高低與乳腺癌及乳腺癌患者生存期相關(guān)性。

2.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用 SPSS17.0 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異采用雙側(cè)t檢驗進(jìn)行分析。其中，** 表示P＜0.01；*** 表示P＜0.001。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞 MCF7 中 TRIM25蛋白表達(dá)上調(diào)

本實驗使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激陽性誘導(dǎo)劑 TM 和TG 處理 MCF7 細(xì)胞 6 h 以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時將 TM、TG 的溶劑 DMSO 作為對照處理同樣時間，收集細(xì)胞檢測 TRIM25 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(78 kDa Glucose-Regulated Protein，GRP78/Bip)的 mRNA 水平。由圖 1(a)可知，與 DMSO 處理組相比，TM、TG 處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物 GRP78/Bip mRNA水平顯著上升，同時 TRIM25 mRNA 水平也顯著上升。此外，由于蛋白表達(dá)比 mRNA 變化反應(yīng)慢，故從 TM、TG 處理細(xì)胞 12 h 后收集細(xì)胞檢測 TRIM25 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物 GRP78/Bip的蛋白水平可知(如圖 1(b))，與 DMSO 處理組相比(以β-tubulin 為內(nèi)參)，TM、TG 處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物 GRP78/Bip 蛋白水平大幅上升，同時 TRIM25 蛋白水平也大幅上升。以上結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下，乳腺癌細(xì)胞MCF7 可誘導(dǎo) TRIM25 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著上升。

3.2 TRIM25 敲低誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活 UPR信號通路

通過實時熒光定量 PCR 檢測 MCF7 細(xì)胞系穩(wěn)定敲低 TRIM25 的效果。由圖 2(a)可知，與 shNC 相比，shTRIM25-1 和 shTRIM25-2 中TRIM25 的 mRNA 表達(dá)水平顯著降低；直接反映細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度的 GRP78/Bip 水平顯著上升，表明在 MCF7 中敲低 TRIM25 可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時 TRIM25 在乳腺癌細(xì)胞 MCF7 中的表達(dá)變化Fig.1 Changes of TRIM25 expression in breast cancer cells MCF7 under ER stress

圖2 TRIM25 敲低對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及 UPR 信號通路下游基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of TRIM25 knockdown on ER tress and expression of downstream gene in UPR signaling pathway

未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所激活的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制體系。該體系相關(guān)信號通路的活化，能夠反饋調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，對于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。通過檢測 UPR信號通路中sXBP1、ATF4、CHOP基因的 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，敲低 TRIM25 后這 3個基因的 mRNA 表達(dá)顯著升高(圖 2(b))。該結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞 MCF7 中敲低 TRIM25 可激活 UPR 信號通路。

3.3 TRIM25 敲低促進(jìn) UPR 通路關(guān)鍵蛋白的激活

通過免疫印跡，初步檢測上述 TRIM25 穩(wěn)定敲低細(xì)胞系中 UPR 信號通路關(guān)鍵蛋白的變化。結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白 GRP78/Bip 明顯上調(diào)，UPR 通路下游的磷酸化 eIF2α上調(diào)但總eIF2α不變，磷酸化 JNK 明顯上調(diào)而總 JNK 無明顯變化(圖 3)，表明 TRIM25 蛋白敲低后明顯激活 eIF2α及 JNK 等 UPR 關(guān)鍵信號通路。該結(jié)果進(jìn)一步說明 TRIM25 的缺失能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并激活 UPR 通路。

3.4 TRIM25 敲低顯著促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

圖3 TRIM25 敲低對 UPR 信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of TRIM25 knockdown on expression of the key protein in UPR signaling pathway

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條重要的細(xì)胞凋亡途徑，而 JNK 是目前已知的促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的關(guān)鍵分子之一。由上述結(jié)果推測，敲低 TRIM25 很可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本文使用 DMSO、TM 及 TG 分別處理TRIM25 敲低細(xì)胞系，12 h 后通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，TRIM25 的缺失導(dǎo)致 DMSO 處理的細(xì)胞凋亡率顯著增高，并能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激藥物處理的細(xì)胞凋亡率有極顯著上升(如圖 4)，表明敲低TRIM25 顯著促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF7 凋亡。

圖4 TRIM25 敲低對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of TRIM25 knockdown on endoplasmic reticulum stress induced cell apoptosis

3.5 乳腺原發(fā)上皮轉(zhuǎn)化為乳腺癌細(xì)胞過程伴隨TRIM25 蛋白水平上調(diào)

通過免疫印跡檢測不同乳腺細(xì)胞系 MCF 10A、MCF7 和 MDA-MB-231 中 TRIM25 的蛋白水平。其中，MCF 10A 為正常乳腺上皮細(xì)胞；MCF7 為原位乳腺癌細(xì)胞；MDA-MB-231 為惡性高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞。結(jié)果表明，乳腺原發(fā)上皮轉(zhuǎn)化為乳腺癌細(xì)胞過程伴隨 TRIM25 蛋白水平上調(diào)(如圖 5)，提示 TRIM25 蛋白在乳癌細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要功能。

圖5 不同乳腺細(xì)胞中 TRIM25 的表達(dá)量差異Fig.5 The expression of TRIM25 in different breast cells

3.6 TRIM25 高表達(dá)顯著降低乳腺癌病人生存期

利用 CPTAC 數(shù)據(jù)庫查詢正常乳腺組織和原位乳腺癌組織中TRIM25的蛋白表達(dá)量并分析發(fā)現(xiàn)：與正常組織(n＝18)相比，TRTM25 在原位乳腺癌組織(n＝125)中的表達(dá)水平有顯著性上調(diào)(P＜0.001)，如圖 6(a)所示。

此外，為分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫中浸潤性乳腺癌患者 TRIM25 表達(dá)量與生存期的關(guān)系，將患者分為 TRIM25 高表達(dá)(n＝481)和低表達(dá)(n＝481)兩組，并比較兩組間患者的總生存率。結(jié)果顯示，在 TRIM25 高表達(dá)組中乳腺癌患者的生存期顯著降低(圖 6(b))，表明 TRIM25 的表達(dá)水平與乳腺癌病人的生存期負(fù)相關(guān)。

圖6 生物信息學(xué)分析 TRIM25 表達(dá)量與乳腺癌患生存期關(guān)系Fig.6 Bioinformatics analysis of TRIM25 expression and survival of breast cancer patients

4 討 論

乳腺癌的發(fā)病過程是極其復(fù)雜的，雖然靶向治療給乳腺癌患者帶來了極大的希望，但由于人們對其分子機(jī)制的研究至今仍處于探索階段。目前可作為臨床診斷、靶向治療以及預(yù)后標(biāo)志的有效分子靶點(diǎn)還很缺乏，因此尋找新的乳腺癌關(guān)鍵基因是乳腺癌研究的重要內(nèi)容。

目前，大部分研究焦點(diǎn)集中在那些可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)的靶基因上，希望能尋找到新的治療靶點(diǎn)，為臨床治療提供新思路。近來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡逐漸成為一個新的研究方向，揭示該過程中重要蛋白的作用引起了人們的關(guān)注。已有報道稱 TRIM13 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中通過其螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[21]，但 TRIM 家族其他成員參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程還未有相關(guān)報道。本文利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)陽性藥物 TM、TG 體外處理細(xì)胞，通過實時熒光定量 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)多種 TRIM 家族蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時表達(dá)量有顯著變化，其中TRIM25 變化尤為顯著，因此推測 TRIM25 是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程的重要蛋白。故設(shè)計圖 7(a)實驗思路探究 TRIM25 與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

大量研究表明，TRIM25 所屬的 TRIM 家族蛋白與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。例如，TRIM11 高表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞降解錯誤折疊蛋白的能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[16]；TRIM28 在早期肺癌中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能[22]；TRIM32 通過負(fù)調(diào)節(jié) p53 功能促進(jìn)腫瘤發(fā)生[23]。TRIM25 同樣在多種腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色，如促進(jìn)胃癌[24]、肺癌[25]的發(fā)展。此外，更有多項研究表明，TRIM25 作為一種雌激素受體，參與調(diào)節(jié)雌激素相關(guān)腫瘤的進(jìn)展，與乳腺癌的關(guān)系尤為密切。在乳腺癌惡化過程中，TRIM25 的表達(dá)量顯著上調(diào)促進(jìn)其靶蛋白腫瘤抑制因子 14-3-3σ的水解，從而加劇乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)化[26-27]。有報道稱 TRIM25 是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其活性的改變在一定程度上決定了乳腺癌的轉(zhuǎn)移表型。Walsh等[28]通過系統(tǒng)生物學(xué)方法確定了 TRIM25 是乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵決定因素。以上研究暗示 TRIM25在乳腺癌的臨床治療中具有潛在的重要性，這與本文的研究結(jié)果一致，但目前關(guān)于 TRIM25 如何調(diào)節(jié)乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制尚不清楚。因此，揭示 TRIM25 與乳腺癌之間的新型調(diào)控機(jī)制，可為未來臨床上乳腺癌的早期診斷和臨床治療提供新思路和理論支持。

圖7 實驗流程及 UPR 信號通路示意圖Fig.7 The diagram of experemental scheme and UPR signaling pathway

本文研究發(fā)現(xiàn)，TRIM25 是一種新型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白。當(dāng)乳腺癌細(xì)胞 MCF7 處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，其表達(dá)顯著上調(diào)。此外，TRIM25 敲低會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、激活 UPR 信號通路并顯著促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的 MCF7 細(xì)胞凋亡(如圖 7(b))。生物信息學(xué)分析表明，TRIM25 高表達(dá)與乳腺癌患者的生存率較低相關(guān)。鑒于以上結(jié)果，初步判斷 TRIM25 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞生長，有望成為乳腺癌臨床診斷的指標(biāo)和治療的新靶點(diǎn)。

本研究也存在一定局限性，如只檢測了TRIM25 敲低對乳腺癌細(xì)胞的影響，缺少對TRIM25 過表達(dá)的研究。有報道稱在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TRIM25 靶向 ERG(轉(zhuǎn)錄因子家族Ets 相關(guān)基因)癌基因，使該基因發(fā)生多聚泛素化降解[29]。這表明 TRIM25 在各種癌癥中的作用具有兩面性，可作為癌基因也可以作為抑癌基因發(fā)揮作用；檢測 TRIM25 對細(xì)胞凋亡影響的同時還可檢測對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。因此，要更深入探明 TRIM25 的生物學(xué)功能還需進(jìn)一步研究。

5 結(jié) 論

TRIM25 是一種新型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，它可通過參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的存活，這是一種新的腫瘤細(xì)胞調(diào)控體系。其中，隨著乳腺癌細(xì)胞惡性程度的加劇，TRIM25 表達(dá)量顯著上升，導(dǎo)致乳腺癌患者生存率明顯降低。本研究結(jié)果提示，TRIM25 與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，有望成為乳腺癌治療和預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。