周 寧

（陜西科技大學 鎬京學院，陜西 西安 712000）

姬松茸（Agaricus blazei） 原產(chǎn)巴西、秘魯?shù)鹊?，因此又稱巴西蘑菇[1]。引入我國后，由于其良好的藥用價值，被廣泛應(yīng)用于癌癥、白血病等疾病的輔助治療中，尤其是抗癌的效果十分明顯，被譽為抗癌神藥。姬松茸的主要抗癌成份為多糖[2]。目前的研究成果多是集中在姬松茸大分子多糖上，而對于分子量比較小的多糖，即低分子量多糖對人體健康影響的文獻比較欠缺。通過將大分子量的姬松茸多糖降解為低分子量姬松茸多糖，并對其改善人體健康、增強人體機能方面的作用進行研究，更深入地挖掘姬松茸的藥用價值，使之更好地服務(wù)于人類健康。

1 姬松茸多糖的藥用價值

姬松茸是已知生物抗癌領(lǐng)域功效顯著的真菌之一，姬松茸的成活率比較低，并且生產(chǎn)季節(jié)比較短，由于過度開采，野生姬松茸資源匱乏，但我國人工栽培姬松茸技術(shù)已經(jīng)成熟。充足的原材料使姬松茸多糖成為了研究和開發(fā)的熱點。

姬松茸的形態(tài)形似饅頭，菌蓋呈黑褐色，菌桿一般為白色，顏色對比鮮明。姬松茸主要功效成分是多糖常存在于其子實體中，菌絲體中也有一定含量。目前關(guān)于姬松茸多糖的提取、抗癌機理及分子結(jié)構(gòu)研究十分廣泛。真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的多糖類物質(zhì)，并可以在體內(nèi)通過控制細胞分裂分化、同時調(diào)節(jié)細胞生長和衰老的而起到活性作用，一般是由10 個分子以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的大分子化合物。其藥效的研究多集中在抗癌效果上，已有文獻研究表明[2]，姬松茸多糖對乳腺癌、肝癌和胃癌等抑制效果良好，具有很好的抗癌效果，而且無毒副作用?，F(xiàn)將姬松茸多糖的藥用價值介紹如下。

1.1 抗癌作用

姬松茸多糖抗癌活性是目前研究的熱點，姬松茸子實體水提物主要是多糖物質(zhì)，而對S180 肉瘤細胞等癌細胞具有很好的抑制作用?？拱┕δ苤饕ㄟ^刺激機體產(chǎn)生特異性免疫與非特異性免疫而起到免疫調(diào)節(jié)作用。一方面，姬松茸多糖還通過抑制癌細胞轉(zhuǎn)移、抗突變或降低肝線粒體中藥物代謝酶等活性，對腫瘤直到抑制和預(yù)防作用。另一方面，姬松茸多糖還可以在細胞周期的不同階段破壞細胞壁的形成，從而對腫瘤細胞起到直接殺傷，達到抑制并殺死癌細胞的作用。

1.2 抗氧化、抗衰老作用

姬松茸多糖像多數(shù)真菌一樣，具有很好的抗衰老功能，許多通過對小鼠等動物的試驗表明，姬松茸多糖能夠有效延長小白鼠的抗氧化指標和總抗氧化能力[3]，并通過試驗測定小白鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN） 和肌酐（CRE） 含量的變化，說明了姬松茸多糖對小白鼠的肝臟、腎臟等臟器細胞的保護作用，延緩了器官的衰老，減輕了過氧化物對機體組織細胞的損害。

1.3 抑菌作用

戴肖東、張介弛等[4]對姬松茸的抑菌作用進行了研究，采用了雙平板法和比濁法測定了姬松茸的抑菌效果，結(jié)果表明姬松茸子實體水提取液對大腸桿、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果。而進一步研究表明，姬松茸子實體浸提物的主要成份就是多糖，因此，姬松茸多糖具有較好抗菌、抑菌效果。

1.4 抗纖維化

陳蘭芬、李英信等人分別在姬松茸多糖對小鼠、大鼠細胞免疫活性方面進行了試驗，觀察了姬松茸多糖對小鼠、大鼠的免疫活性的影響[5-6]。試驗結(jié)果表明，姬松茸多糖可提高大鼠肝枯否細胞的免疫活性，顯著增強小鼠的免疫功能，有較好的免疫調(diào)節(jié)作用。

1.5 其他藥理作用

姬松茸多糖還具有降血糖、抗血栓生成、保護肝臟等多種生理功效。其主要成份是姬松茸多糖中含有的10 余種氨基酸及鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)元素，是人體健康必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素。

2 低分子姬松茸多糖活性試驗

研究表明，姬松茸中有藥理活性的物質(zhì)主要是多糖，但其多糖的提取極其抗癌效果的研究多是大分子結(jié)構(gòu)的多糖，這是由于多糖本身就是分子量龐大的糖類物質(zhì)，普遍存在于真菌中。但對于低分子的姬松茸多糖研究較少，低分子多糖在姬松茸中活性成分與高分子多糖的差異與其抗癌作用的功效如何還有待探討。針對姬松茸多糖進行提取純化，得到低分子姬松茸多糖，并對提取純化結(jié)果進行檢測，以確定低分子姬松茸多糖的提取最佳工藝；在此基礎(chǔ)上進行體外抑腫瘤試驗，以找出低分子姬松茸多糖體外抗癌的抗癌活性差異，以確定低分子姬松茸多糖對人體健康的改善作用和效果。

2.1 主要試劑藥品

主要試劑藥品如表1 所示。

表1 試驗主要試劑Tab. 1 Main test reagents

2.2 主要試驗儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備如表2 所示。

表2 試驗主要儀器設(shè)備Tab. 2 Main test instruments and equipment

3 低分子姬松茸多糖提取與純化

3.1 低分子姬松茸多糖提取

姬松茸多糖提取以水提法最常見，水提法條件溫和、操作簡單而且不影響多糖結(jié)構(gòu)，但提取效率較低、資源浪費較大。為了減少姬松茸多糖大分子多糖的比例，獲得低分子姬松茸多糖，以姬松茸子實體干粉為試驗材料，采用復(fù)合酶法提取對姬松茸子實體多糖的提取工藝進行優(yōu)化。

復(fù)合酶法提取在pH 為4.8，溫度50℃時，復(fù)合提取酶有最高活性，因此，試驗選擇在此環(huán)境下對姬松茸子實體干粉進行復(fù)合酶法提取。

在復(fù)合酶法提取中，粗多糖（PE1，%） 得率計算公式為：

式中：m1為粗多糖質(zhì)量（g）；m2為原材料質(zhì)量（g）。

以苯酚-硫酸法計算提取液中多糖含量，多糖提取率按式（2） 計算：

式中：m3為提取液中多糖質(zhì)量（g）；m2為原材料質(zhì)量（g）。

3.1.1 對比試驗

精確稱取姬松茸子實體干粉0.3 g，按料液比為1∶100 加蒸餾水，各加入纖維素酶2.5 mg、木聚糖酶1.2 mg、β-葡聚糖酶2.0 mg、果膠酶1.8 mg。50℃水浴恒溫振蕩器中酶解120 min 后，85℃滅酶活30 min。提取液經(jīng)3 500 r·min-1離心15 min。

其中料液比、酶解時間、纖維素酶加量、木聚糖酶加量、β-葡聚糖酶加量、果膠酶添加數(shù)量需根據(jù)姬松茸子實體干粉的實際情況，通過多次單因素試驗確定合適的比例和添加數(shù)量。

3.1.2 正交試驗

為進一步考察以上料液比、酶解時間和幾種酶加量對結(jié)果的提取效果的影響，根據(jù)對比試驗確定的條件范圍，對以上各影響因素進行正交試驗。每個條件下取姬松茸子實體粉末各0.3 g，依正交表設(shè)計方案進行多糖提取，提取液經(jīng)3 500 r·min-1離心15 min，取上清液測定多糖含量，根據(jù)多糖提取率以確定復(fù)合酶法提取最佳工藝條件。

3.1.3 追加重現(xiàn)性試驗

稱取姬松茸子實體干粉0.3 g，按照正交試驗所選取的最佳提取條件進行重復(fù)試驗，以驗證重現(xiàn)性。試驗重復(fù)3 次。

3.2 試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗中發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)增加浸提用水量有助于提高提取率；多糖提取率隨時間延長多糖提取率有所增加；多糖提取率隨纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶的加量有所提高。但提取率曲線都會在出現(xiàn)峰值后趨于平緩。

正交試驗結(jié)果顯示，各因素對多糖提取率均有不同影響，影響多糖提取率主次因素為β-葡聚糖酶>時間>木聚糖酶>果膠酶＝料液比>纖維素酶；其中，β-葡聚糖酶的影響極顯著，時間影響具有顯著性，而其它各因素沒有顯著性。

由正交分析得到各因素最佳組合即是復(fù)合酶法提取的最優(yōu)工藝條件為料液比為1 ∶90，提取時間為140 min，纖維素酶2.2 mg（1.10%），木聚糖酶0.9 mg（0.45%），β-葡聚糖酶2.5 mg（1.25%），果膠酶0.6 mg（0.3%）。由于正交試驗表中無此組合，因此需做追加試驗。

追加重現(xiàn)性試驗結(jié)果顯示，多糖提取率均在6.50%以上，考慮到加酶量的經(jīng)濟性，該方案更為科學合理。

3.3 低分子姬松茸多糖純化

由于姬松茸子實體多糖組成的復(fù)雜多樣性，既有多糖和蛋白質(zhì)，又有二者的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此提取所得粗多糖需進一步分離純化。采用陰離子交換柱層析法對低分子姬松茸多糖進行純化是目前常見的一種方法，用于分離低分子姬松茸多糖中的粘多糖、中性多糖和各種酸性多糖。干燥后得到的粗多糖可經(jīng)脫蛋白處理后，再經(jīng)離子交換柱和凝膠柱純化得到精制多糖。多數(shù)試驗對粗多糖的研究流程依次為提取、分離、純化，再對純化得到的多糖進行純度鑒別、組分測定、結(jié)構(gòu)分析、理化性能和藥理活性的分析。

4 低分子姬松茸多糖抗癌活性檢測

4.1 抗癌活性試驗方法

將濃度為5×104個/mL 的處于對數(shù)生長期的肝癌HepG-2 細胞植于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。之后，每孔加入低分子姬松茸多糖溶液（濃度為600 μg·mL-1） 和陽性對照藥氟尿嘧啶（濃度為600 μg·mL-1） 各100 μL，空白對照組取培養(yǎng)基100 μL。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h 后，傾斜法棄上清，每孔加入濃度為5 mg·mL-1的MTT 液20 μL 后，同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標儀于570 nm 波長處檢測各孔OD值，細胞生長抑制率（CE，%） 計算公式為：

式中：OD1為試驗組細胞OD值；OD2為對照組細胞OD值。

4.2 試驗結(jié)果與分析

試驗采用肝癌HepG-2 細胞檢測低分子姬松茸多糖抑制癌細胞程度。不同純度多糖的抑制率相差較大。多糖體外抗癌結(jié)果如表3 所示。

表3 低分子姬松茸多糖對HepG-2 細胞的抑制作用Tab. 3 Inhibition of low molecular weight Agaricus blazei polysaccharide on HepG-2 cells

由表3 可知，低分子姬松茸多糖對肝癌HepG-2 細胞的抑制率最高，達到44.32%；比普通姬松茸純化后的多糖高了21.89%，而提純后的低分子姬松茸多糖抑制率最低，只有28.18%。

抗癌試驗結(jié)果分析。低分子姬松茸多糖中由于含有的低分子量多糖，其溶解性更好，黏度低，易于吸收，可能更容易和一些腫瘤癌細胞分子進行結(jié)合或誘導(dǎo)腫瘤細胞的調(diào)亡，從而產(chǎn)生抗癌的抑制效果。因此相比普通多糖的抗癌效果要更好。

但經(jīng)過純化后的低分子姬松茸多糖，抑制率反而會出現(xiàn)降低。分析其可能的原因是由于真菌多糖是其中的多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，即糖蛋白而發(fā)揮了一定的抗癌效果，提純后由于過濾去除了大量蛋白質(zhì)而致使均一多糖的抑制癌細胞活性降低，這說明某些蛋白質(zhì)在低分子姬松茸多糖的抗癌功效上起著重要作用。同時也證明均一多糖其含糖量雖然很高，但抗癌活性卻有較大降低。

5 總結(jié)

姬松茸因其巨大的藥用價值必將受到人們的廣泛關(guān)注。低分子姬松茸菌的抗癌活性已有一些研究成果，但由于其低分子的結(jié)構(gòu)和與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的方式還不清楚。因此在其抗癌、抗腫瘤的功效上還有待進一步的研究。

通過對低分子姬松茸多糖的提取和純化方法進行了試驗，通過單因素試驗與正交試驗確定了提取最佳條件；并使用肝癌HepG-2 細胞檢測各多糖抗癌效果。后續(xù)還應(yīng)對其他癌癥的抗癌功效進行深入研究。