羅軒，田爍冉，李秋妹，蔡少麗，賴俊忠

論著

AMPK通過抑制STING調(diào)節(jié)干擾素免疫應(yīng)答通路的研究

羅軒，田爍冉，李秋妹，蔡少麗，賴俊忠

366000 福州，福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心/福建省天然免疫生物學重點實驗室

探索腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）與 cGAS-STING 通路之間的聯(lián)系及其在先天免疫中扮演的角色。

利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、RT-qPCR 等方法，探究 AMPK 對 DNA 相關(guān)免疫通路的調(diào)控機制。

在 HT-DNA 和 cGAMP 刺激下，AMPK-/-細胞株的 IFN-β 的表達量明顯高于野生型細胞株，但這種變化在 RNA 信號通路中并不明顯；激活 AMPK 可以抑制細胞內(nèi)的 DNA 信號通路；在 DNA 信號通路中，AMPK-/-細胞株相較于野生型細胞株，STING 在 RNA 和蛋白水平上都明顯升高，即AMPK 對 cGAS-STING 通路的抑制很可能是通過抑制 STING 起作用。

AMPK 在調(diào)節(jié) cGAS-STING 介導(dǎo)的干擾素免疫應(yīng)答中起重要作用。

先天免疫； 能量代謝； AMP 活化蛋白激酶類； cGAS-STING 信號通路

人體內(nèi)的任何生命活動都離不開能量，能量代謝作為細胞進行生命活動的基本特征，其代謝水平的穩(wěn)態(tài)在機體的生長和機能中扮演著至關(guān)重要的角色。而作為細胞能量代謝的調(diào)節(jié)中樞，腺苷酸活化蛋白激酶（5' AMP-activated protein kinase，AMPK）能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝以維持細胞能量穩(wěn)態(tài)并防止代謝應(yīng)激，在細胞的增殖、分化、凋亡等方面都起著十分重要的作用[1-3]。AMPK 屬于高度保守的真核蛋白質(zhì)，由 α、β、γ 三個亞基按照 1:1:1 的比例組成，是一種多亞基蛋白。AMPK 的 α 亞基為催化亞基，對蛋白激酶復(fù)合物的活性起決定作用，而調(diào)節(jié)亞基 β 和 γ 只在一定程度上參與該過程[4-5]。

先天免疫應(yīng)答反映了宿主在防御病原體入侵或內(nèi)源性組織損傷等方面的基本能力[6]。病毒 RNA，細胞質(zhì) DNA 和細菌細胞壁組分脂多糖通過模式識別受體（PRR）-偶聯(lián)蛋白如 RIG-I-MAVS、cGAS-STING 和 TLR3/4-TRIF 激活信號級聯(lián)反應(yīng)[7-9]。這些信號傳導(dǎo)模塊的激活導(dǎo)致 I 型干擾素（IFN-β）的產(chǎn)生，IFN-β 是宿主防護所必需的細胞因子家族。銜接蛋白 MAVS、STING 和 TRIF 各自激活下游蛋白激酶 TBK1，然后磷酸化轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子 3（IRF3）從而驅(qū)動I 型干擾素的產(chǎn)生[10-11]。而 AMPK 作為錯綜復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中樞，在適應(yīng)性免疫和先天免疫中扮演的角色也正在逐步被揭示。胞質(zhì) DNA 的識別會有效地減少葡萄糖的代謝，從而導(dǎo)致 ATP 耗竭和 AMPK 介導(dǎo)的細胞能量應(yīng)激反應(yīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 通過磷酸化 UNC-51-like kinase 1（ULK1）從而抑制了 STING 下游的信號通路[13]。相反，另一項研究表明，AMPK 通過磷酸化 STING 上的 S366位點，進而激活 STING 依賴的信號通路[11]。

近幾年胞漿 DNA 識別通路的研究異?；钴S，然而，對于胞漿 DNA 識別通路和能量代謝的關(guān)系還知之甚少。之前關(guān)于哺乳動物的研究表明，機體抵御外來病原微生物所引發(fā)的一系列免疫反應(yīng)是一個非常耗能的過程，影響著包括蛋白質(zhì)和脂類在內(nèi)等多個生理代謝相關(guān)途徑[14-15]。然而，AMPK 與先天免疫之間存在什么樣的聯(lián)系；能量感受器在先天免疫中到底扮演著怎么樣的角色；機體是如何通過感應(yīng)能量變化而啟動免疫防御機制的尚不清楚。這使得探索并研究 AMPK 與先天免疫機制的相互關(guān)系變得異常重要。本研究通過對 AMPK 與干擾素通路相關(guān)機制的研究，發(fā)現(xiàn) AMPK 對 cGAS-STING信號通路具有抑制作用，且這一抑制作用是通過 STING 介導(dǎo)的，使我們對腺苷酸活化激酶在核酸免疫識別通路中的作用有了初步的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌細胞（AGS）、人皮膚成纖維細胞（BJ）均購自中科院上海細胞所；小鼠成纖維細胞 L929 購自美國 ATCC；Lipofectamine 2000 Reagent 購自美國 Invitrogen 公司；p-AMPK、AMPK、β-actin、STING、GAPDH 的一抗均購自美國 Abcam 公司；DMEM 和 F12 細胞培養(yǎng)液、FBS、胰蛋白酶均購自美國 Gibco 公司；Real-time PCR 試劑包括 TRIzol 和 SYBR Premix EX Taq購自日本 Takara 公司；pX459 質(zhì)粒和 PEGFP-N1質(zhì)粒購自美國Addgene 公司；HT-DNA 和 Poly(I:C) 均購自美國 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取–80 ℃下保存的 AGS 細胞、BJ 細胞和 L929 細胞至 10 cm 的細胞培養(yǎng)皿中，以含有 10% FBS、1% 青鏈霉素的 DMEM/F12 細胞培養(yǎng)液復(fù)蘇后，于 37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。當細胞密度達 90% 時，以 1:3 的比例傳代到 2 個 10 cm 培養(yǎng)皿，每 1 ~ 2 天換新鮮培養(yǎng)液，供后續(xù)實驗使用。

1.2.2 細胞活力測定 A-769662 對 BJ 細胞的活性與增殖影響采用CCK-8法進行檢測。接種細胞懸液于 96 孔板中（每孔 100 μl）培養(yǎng) 24 h；將A-769662 配置成質(zhì)量濃度為 200 μmol/ml 的母液，然后將其用培養(yǎng)基稀釋成 200、100、50、40、30、20、10、1 μmol/ml 8 個質(zhì)量濃度梯度的工作液，每組設(shè)置 5 個重復(fù)，每孔加入 1 μl 不同質(zhì)量濃度的 A-769662 工作液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育 12 h。孵育完成后，先沿細胞板壁加入每孔 10 μl 的 CCK-8 溶液，輕輕混勻，再將 96 孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 3 h，之后用酶標儀于 450 nm 處測定吸光值（值），并用以下公式計算：細胞存活率=[（實驗組–空白組）/（對照組–空白組）]× 100%。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 接種 1.0 × 106個細胞至 6 孔板過夜培養(yǎng)。第 2 天加質(zhì)粒前，給細胞換上新鮮培養(yǎng)液，每個轉(zhuǎn)染孔按下列比例混合：取 2 μmol/ml 核酸（DNA 或 RNA）溶于 50 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)液中；取 Lipofectamine 2000:核酸為 2:1 的量的Lipofectamine 2000 溶于 50 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)液中，室溫靜置 5 min。把核酸混合液加入至 Lipofectamine 2000 混合液中充分混勻，室溫靜置 15 min 后，加入細胞中。然后將細胞置于 37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行后續(xù)篩選。

還有，在教學中，由于多方面原因，教師普遍存在只講授大綱內(nèi)容，完成教學任務(wù)，而忽略了對計算思維的培養(yǎng)，沒有循序漸進地向?qū)W生傳遞計算思維的相關(guān)概念和使用方法，沒有注重培養(yǎng)學生的計算思維能力。

1.2.4 基因敲除的 sgRNA 序列 h-AMPKα1：5' AAGATCGGCCACTACATTC 3'；h-AMPKα2：5' AG GCCGCGCGCGCCGAAGA 3'；m-AMPKα1：5' CGA GTTGACCGGACATAAAG 3'；m-AMPKα2：5' CCT GAAGCGAGCGACTATCA 3'。

1.2.5 CRISPR/Cas9 敲除載體的構(gòu)建 上下游引物混合物退火體系：上游引物 5 μl（100 μmol/L），下游引物 5 μl（100 μmol/L），5 × 退火緩沖液 10 μl，無菌水 30 μl，共 50 μl。退火條件：95 ℃ 2 min，每 90 秒降低 1 ℃。使用BI 對 pX459 空載體進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物，膠回收酶切后的空載體 pX459/BI，核酸定量分析儀測回收空載體濃度，取回收的空載體 50 ng，空載酶切產(chǎn)物與目的基因酶切產(chǎn)物在16 ℃、8 h 條件下連接，連接產(chǎn)物于 4 ℃保存。將重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，并同時設(shè)置陰性和陽性對照，涂布于氨芐抗性的 LB 培養(yǎng)基，于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取含重組連接產(chǎn)物的單克隆，接種于含氨芐抗性的 LB 培養(yǎng)液，于 37 ℃恒溫搖床 300 r/min 振搖過夜。離心，棄去上清，用質(zhì)粒提取試劑盒 40 μl 洗提液抽提。pX459- AMPKα1-sgRNA 和 pX459-AMPKα2-sgRNA 質(zhì)粒測序確定 AMPKα1 和 AMPKα2 基因的插入。

1.2.6 AMPK 敲除的 L929 細胞和 AGS 細胞篩選 接種 5 × 105AGS 細胞和 L929 細胞至六孔板過夜培養(yǎng)；第 2 天加質(zhì)粒前，更換培養(yǎng)液，利用Lipofectamine 2000 將提取的重組質(zhì)粒 pX459-KO-h-AMPKα1、pX459-KO-h-AMPKα2，pX459-KO-m-AMPKα1 和 pX459-KO-m-AMPKα2 分別轉(zhuǎn)染到 AGS 細胞和 L929 細胞中，并做一個PEGFP-N1質(zhì)粒作對照。24 h 后換液，每天定時加入 Puromycin 進行篩選（Puromycin 對 L929 細胞的最小致死濃度為 8 μg/ml，對 AGS 細胞的最小致死濃度為 0.7 μg/ml）；藥物篩選至對照孔的細胞全部死亡為止（約 5 d）。將細胞消化后，取一半提取基因組做初步的測序，另取一小部分轉(zhuǎn)移至10 cm 板中培養(yǎng)，在細胞長成肉眼可見的單克隆后，挑取單克隆細胞株。

1.2.7 TRIzol 法提取細胞總 RNA 和定量PCR 用 TRIzol 法提取 L929 細胞和 AGS 細胞總 RNA，過程詳見試劑說明。使用核酸定量分析儀測 RNA 濃度。逆轉(zhuǎn)錄過程如下：42 ℃ 2 min，冰上迅速冷卻，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，–20 ℃保存。將 cDNA 用 DEPC 水稀釋到 50 ng/μl，對照組 cDNA 和實驗組 cDNA 用實時熒光定量 PCR 檢測。

1.2.8 Western blot 將各組細胞抽提總蛋白質(zhì)，用 BCA 法測定樣品蛋白含量，以上樣蛋白總量為 40 μg 配制蛋白上樣液，各組蛋白上樣液經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉 1 h 后敷一抗 4 ℃過夜，再經(jīng)洗膜3 次，常溫敷二抗 1 h 后洗膜 3 次并曝光。

2 結(jié)果

2.1 AMPK 基因敲除的 L929 細胞和 AGS 細胞的構(gòu)建和鑒定

2.2 AMPK 敲除的 L929 細胞株與干擾素免疫應(yīng)答通路的關(guān)系

為了探究 AMPK 與 cGAS-STING 通路的關(guān)系，利用 HT-DNA 刺激 L929-WT 細胞株和 L929-AMPK-/-單克隆細胞株 6 h，Poly(I:C) 刺激 8 h 和 cGAMP 刺激 2 h，RT-qPCR 檢測 IFN-β mRNA 的表達情況。結(jié)果顯示，利用 HT-DNA 和 cGAMP 刺激時，L929-AMPK-/-細胞的 IFN-β 表達顯著高于野生型細胞，而用 Poly(I:C) 刺激時，野生型 L929 細胞株和 AMPK 敲除細胞株的 IFN-β 表達無顯著性差異（圖 2A）。另外，HT-DNA刺激 L929-WT 和 L929-AMPK-/-細胞不同的時間后進行半定量 PCR（圖 2B）。結(jié)果與RT-qPCR 結(jié)果一致。這些結(jié)果證明了 AMPK 對 cGAS-STING 通路具有抑制作用，而對 RIG-1 通路無顯著作用，且 AMPK 抑制位點可能存在于 cGAS-STING 通路中 cGAMP 的下游區(qū)域。

圖 1 構(gòu)建和驗證AMPK 敲除細胞系（A：比對重組質(zhì)粒序列和sgRNA；B：蛋白質(zhì)印跡分析鑒定了L929 細胞和L929-AMPK-/-細胞中的p-AMPK 和AMPK 蛋白；C：蛋白質(zhì)印跡分析鑒定了AGS細胞和AGS-AMPK-/-細胞中的AMPK 蛋白）

Figure 1 Construction and verification of AMPK knockout cell lines(A:Alignment recombinant plasmid sequence and sgRNA; B:Western blot analysis identified p-AMPK and AMPK protein in L929 cell and L929-AMPK-/-cells; C:Western blot analysis identified AMPK protein in AGS cell and AGS-AMPK-/-cells)

圖 2 L929 細胞系敲除AMPK 后與干擾素免疫應(yīng)答途徑的關(guān)系（A：RT-qPCR 測定用HT-DNA、cGAMP 和Poly(I:C) 處理的L929 野生型細胞和L929-AMPK-/-單克隆細胞系中IFN-β 含量；B：半定量PCR 對RT-qPCR 檢測結(jié)果進行驗證；*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 2 Relationship between AMPK knockout L929 cell line and interferon immune response pathway [A:L929-wild type cell and L929-AMPK-/-monoclonal cell lines treated with cGAMP, HT-DNA and Poly(I:C), IFN-β was measured by RT-qPCR; B:Semi-quantitative PCR validates RT-qPCR results;*< 0.05,*< 0.01]

2.3 激活 AMPK 抑制 cGAS-STING 通路

A-769662 是一種特異且有效的 AMPK 激活劑，屬于 Thienopyridone 結(jié)構(gòu)類似物，可以通過變構(gòu)特異性激活 AMPK，并抑制 Thr172 的去磷酸化[16]。因此，我們通過該藥物處理細胞激活 AMPK 可以驗證AMPK 是否會抑制 cGAS-STING 通路。為了確定適宜的 A-769662 質(zhì)量濃度及作用時間，采用了 CCK-8 法檢測了不同質(zhì)量濃度以及處理時間的 A-769662 對 BJ 細胞活性的影響。當 A-769662 質(zhì)量濃度在 1 ~ 50 μmol/ml 時細胞活性并未出現(xiàn)顯著變化，表明在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi) A-769662 對細胞無明顯毒性，但隨著 A-769662 質(zhì)量濃度的逐漸增加，BJ 細胞活性明顯下降（圖 3A）。通過 Western blot 檢測 AMPK 和 p-AMPK 蛋白水平變化，結(jié)果顯示，AMPK 激活劑 A-769962 在 30 μmol/ml 濃度作用 6 h 對 BJ 細胞中 AMPK 的刺激效果最好（圖 3B）。隨后，使用 30 μmol/ml 和 50 μmol/ml 濃度的 A-769662 對 BJ 細胞作用 6 h 后，再用 HT-DNA 刺激細胞，用 RT-qPCR 檢測。結(jié)果顯示，在 BJ 細胞中，激活 AMPK 后再用 HT-DNA 刺激的細胞，其 IFN-β 表達量要明顯低于未用 AMPK 激活劑處理過的細胞（圖 3C）。這些結(jié)果表明，AMPK 的激活會抑制 cGAS-STING，該結(jié)果與 AMPK 缺失激活 cGAS-STING 通路顯示同樣的結(jié)論，即 AMPK 的存在會抑制 cGAS-STING 通路。

2.4 AMPK 可能通過 STING 抑制 cGAS-STING通路

為研究 AMPK 的靶點，對 HT-DNA 時間梯度刺激的細胞進行RT-qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)與野生型細胞株相比，敲除 AMPK 的細胞株，STING 的表達量高出 3 ~ 4 倍（圖 4A）。通過蛋白質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)，在未進行刺激的細胞中，AMPK 敲除細胞株的 STING 總蛋白水平要高于野生型細胞株，在HT-DNA 和 cGAMP 對細胞進行刺激之后這種差異更加顯著（圖 4B和 4C）。在利用 Poly(I:C) 刺激的情況下，野生型細胞和 AMPK 敲除細胞的 STING 蛋白水平的表達量沒有顯著性差異（圖 4D）。這些結(jié)果說明，AMPK 抑制 STING 的表達從而抑制由 HT-DNA 以及 cGAMP 誘導(dǎo)的 IFN-β 的表達，在 AMPK 缺失的情況下會促進 IFN-β 的表達。

圖 3 激活A(yù)MPK 可以抑制cGAS-STING 途徑（A：A-769662 在不同濃度和不同時間對BJ 細胞活性的影響；B：將BJ 細胞用濃度為30 μmol/ml 的A-769662 處理2、4、6、8 和12 h；C：使用30和50 μmol/ml 濃度的A-769662 對BJ 細胞作用6 h 后，再用HT-DNA 刺激細胞，用RT-qPCR 檢測IFN-β的表達情況；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 3 Activate AMPK to inhibit the cGAS-STING pathway(A:Effect of A-769662 at different concentrations and different time on the activity of BJ cells; B:BJ cells were treated with A-769662 at a concentration of 30 μmol/ml for 2, 4, 6, 8 and 12 h. Western blot was perfomed using AMPK and p-AMPK antibodies; C:The BJ cells were activated with A-769662 at 30 and 50 μmol/ml for 6 h, and then treated with HT-DNA. IFN-β was measured by RT-qPCR;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001)

3 討論

AMPK 能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)和葡萄糖代謝以維持細胞能量穩(wěn)態(tài)并防止代謝應(yīng)激，在細胞的增殖、分化、凋亡等方面都起著十分重要的作用，隨著研究的深入，AMPK 在炎癥反應(yīng)與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系也在逐步被揭示。近年來，相關(guān)的研究證明 AMPK 與 DNA 免疫識別通路有著緊密的聯(lián)系，但是報道中存在著一些矛盾。Konno 等[13]認為，AMPK/ULK1 通路顯著抑制 cGAS-STING 通路，而 Prantner等[17]認為，5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid （DMXAA）是一些細胞因子和 I 型干擾素的誘導(dǎo)劑，在小鼠巨噬細胞中響應(yīng) DMXAA 的 IFN-β 的表達需要線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白 STING，線粒體膜電位會調(diào)節(jié) STING 依賴性的 IFN-β 的表達。線粒體膜電位控制鈣穩(wěn)態(tài)，而細胞內(nèi)腺苷酸活化蛋白激酶的活化在一定程度上受鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。他們進而發(fā)現(xiàn)，利用鈣離子螯合劑或者 AMPK 抑制劑處理細胞，并利用 DMXAA 刺激細胞時能抑制 IFN-β 的表達[18]，而Compound C 與 DNA 信號通路的關(guān)系仍有待挖掘，因此該實驗不能直接說明 AMPK 與 DNA 信號通路之間的關(guān)系[19-20]。為了正確地認識兩者之間的關(guān)系，我們展開了此項研究。結(jié)果顯示，在 L929 和 AGS 細胞株中，敲除 AMPK 后都可以增強 DNA 識別通路中的 β 干擾素的表達，而 RNA 識別通路中的 β 干擾素的表達量沒有顯著性差異。這些結(jié)果表明腺苷酸活化蛋白激酶可能具有抑制 cGAS-STING 通路的功能，但 AMPK的敲除與 RNA 相關(guān)信號通路無關(guān)。

同時，我們利用激活劑激活 AMPK，對 AMPK 是否具有抑制 cGAS-STING 通路的功能進一步驗證。A-769662 是一種特異且有效的 AMPK 激活劑，與其他藥理學激活劑不同，它是通過模擬 AMP 的作用，即變構(gòu)激活和抑制去磷酸化而直接激活A(yù)MPK[21-22]。首先，在對 AMPK 激活劑 A-769662進行藥物作用最適濃度及最適時間的預(yù)實驗中，我們確定了 A-769662 的最佳濃度和最佳激活時間為 30 μmol/ml 和 6 h。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，用 HT-DNA 和 cGAMP 分別刺激 AMPK 激活后的 BJ 細胞，I 型干擾素的表達量較于未激活 AMPK 的細胞有顯著性降低，這進一步闡明AMPK 對 cGAS-STING 通路具有抑制作用。

圖 4 AMPK 通過STING 抑制cGAS-STING 通路（A：RT-qPCR 檢測HT-DNA 處理L929 野生型細胞和L929-AMPK-/-細胞系后STING 的表達情況；B：Western blot檢測L929 野生型細胞和L929-AMPK-/-細胞用HT-DNA 處理6 h 后STING 蛋白表達；C：Western blot檢測L929 野生型細胞和L929-AMPK-/-細胞用PFO 輔助cGAMP 處理4 h 后STING 蛋白表達；D：Western blot檢測L929 野生型細胞和L929-AMPK-/-細胞用Poly(I:C) 處理8 h后STING 蛋白表達）

Figure 4 AMPK inhibit cGAS-STING pathway through STING [A:RT-qPCR was performed to determine STING expression of L929-WT cell and L929-AMPK-/-monoclonal cell lines treated with HT-DNA; B:Western blot performed to determine STING expression of L929-WT cells and L929-AMPK-/-cells treated with HT-DNA for 6 h; C:Western blot performed to determine STING expression of L929-WT cells and L929-AMPK-/-cells treated with PFO-assisted cGAMP for 4 h; D:Western blot performed to determine STING expression of L929-WT cells and L929-AMPK-/-cells treated with Poly(I:C) for 8 h]

當細胞感染病原體如病毒、分枝桿菌和細胞內(nèi)寄生蟲時，STING 誘導(dǎo) I 型干擾素產(chǎn)生[23-24]。STING 作為 I 型干擾素信號傳導(dǎo)的直接胞質(zhì) DNA 傳感器和銜接蛋白，很大程度上參與了宿主固有免疫過程，對于識別病原體 DNA 及胞質(zhì)中損傷的 DNA 至關(guān)重要[25-26]。于是，我們利用 RT-qPCR 對 STING 基因的表達量進行檢測。結(jié)果顯示，敲除 AMPK 后的細胞株 STING 表達在RNA 水平有所上升。同時，我們重新利用 HT-DNA、cGAMP 和Poly(I:C)，對 L929-AMPKα-/-細胞株進行刺激，利用 Western blot 對 STING 蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果顯示，在蛋白水平上 STING 的表達變化更加顯著，AMPK 敲除細胞株的 STING 總蛋白水平要明顯高于野生型細胞株的 STING 總蛋白水平，并且，在 HT-DNA 和 cGAMP 對細胞進行刺激之后這種差異更加顯著。這些結(jié)果表明 AMPK 可能是通過抑制 STING 的表達對 cGAS-STING 通路進行抑制的。

過去，針對治療代謝性疾病如糖尿病等對 AMPK 進行了諸多研究[27-28]，近年來，除了腫瘤這一熱點話題，研究者也開始關(guān)注 AMPK 在適應(yīng)性免疫與炎癥方面的機制作用。有研究表明，通過激活 AMPK 可以抑制 LPS/IFN-γ 誘導(dǎo)的 Akt 磷酸化，說明 AMPK 具有成為炎性疾病治療靶標的可能性[29]。不僅如此，在癌癥和炎癥代謝變化中的相似性也表明它們可能存在用于治療這兩種疾病的共同靶標，如 AMPK、mTORC1 或 HIF-1α 等[30]。Sanders 等[31]發(fā)現(xiàn)，由 AICAR 啟動的 AMPK 激活可作為鼠類結(jié)腸炎固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的中樞下調(diào)劑，從而改善先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)過度引起的炎癥性腸病，為我們打開了能量代謝與免疫之間關(guān)系的大門。

綜上所述，AMPK 與干擾素通路的相關(guān)性揭示能量代謝網(wǎng)絡(luò)在機體中的重要性，為探究細胞能量代謝的調(diào)節(jié)中樞與機體先天免疫之間的聯(lián)系打下了堅實的基礎(chǔ)。在未來，AMPK 激活劑有望用于治療自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕關(guān)節(jié)炎和潰瘍性結(jié)腸炎等。AMPK與干擾素通路之間的研究為開發(fā)以 AMPK 為靶點用于治療免疫疾病的新藥物奠定了一定的基礎(chǔ)。

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AMP-activated kinase inhibits IFN pathway through suppression of STING signaling

LUO Xuan, TIAN Shuo-ran, LI Qiu-mei, CAI Shao-li, LAI Jun-zhong

AMP-activated protein kinase (AMPK) is a major regulator of cellular energy metabolism and plays a very key role in cell proliferation, differentiation and apoptosis. Immune responses to invasion of foreign pathogenic microorganisms is a very energy-intensive process. However, the link between AMPK and the cGAS-STING pathway, and its role in innate immunity remains unclear.

We used CRISPR/Cas9 technology, Western blot and RT-qPCR to explore the AMPK regulatory role involved in DNA-related innate immune pathway.

In the stimulation of HT-DNA and cGAMP, the expression level of IFN-β in the AMPK-/-cell lines was significantly higher than that of the wild type cell line, but this change was not obvious in the RNA signaling pathway. Activation of AMPK can also inhibit DNA signaling pathway. Compared with wild type cell lines, AMPK-/-cell lines showed the increases in STING expression at both RNA and protein levels, suggesting that AMPK inhibited the cGAS-STING pathway by inhibiting STING.

These findings provide new insights into the mechanism of AMPK function in the innate immune reponse.

Innate immunity; Energy metabolism; AMP-activated protein kinases; cGAS-STING signaling pathway

s:CAI Shao-li, Email:caishaoli@126.com; LAI Jun-zhong, Email:850408633@qq.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.007

Author Affiliation:Southern Biomedical Research Center/Fujian Key Laboratory of Innate Immune Biology, Fujian 366000, China

福建省自然科學基金面上項目（2017J01621）

蔡少麗，Email：caishaoli@126.com；賴俊忠，Email：850408633@qq.com

2019-10-18