陳珊珊， 朱 鐳， 郭 超， 徐 輝， 郭琳琳， 王穎穎， 孟晉華

流感嗜血桿菌是兒童社區(qū)獲得性感染的常見病原菌，僅次于肺炎鏈球菌。該菌主要引起兒童呼吸道感染，其次可引起患兒中耳炎、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎、化膿性腦膜炎、血流感染等多種疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身體健康[1-2]。近年來，隨著抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，流感嗜血桿菌的耐藥菌株逐漸增多。流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率也逐年上升，耐藥程度日益嚴(yán)重[3]。本研究通過對山西省兒童醫(yī)院2018年患兒臨床分離的1 320株流感嗜血桿菌進(jìn)行回顧性調(diào)查研究，分析其分布、流行特點及耐藥情況，為臨床經(jīng)驗診治提供科學(xué)依 據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2018年1-12月山西省兒童醫(yī)院微生物室在患兒各類標(biāo)本中共檢出流感嗜血桿菌 1 320株（剔除同一患兒相同部位的重復(fù)菌株）。

1.1.2 試劑及儀器 菌株分離采用巧克力平皿，藥敏試驗采用HTM培養(yǎng)基，均購自鄭州安圖生物公司，血培養(yǎng)瓶和腦脊液培養(yǎng)瓶分別由法國梅里埃公司和美國BD公司提供。采用質(zhì)譜儀鑒定流感嗜血桿菌，儀器購自法國梅里埃公司。β內(nèi)酰胺酶檢測的頭孢硝噻吩紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品。藥敏試驗選用9種抗菌藥物，藥敏紙片均購自英國OXOID公司。

1.1.3 質(zhì)控菌株 流感嗜血桿菌質(zhì)譜鑒定質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739，藥敏試驗質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC 49247。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和鑒定 按照操作規(guī)范，將經(jīng)過評估合格的痰標(biāo)本及其他各類標(biāo)本以分區(qū)劃線法接種于血平皿和巧克力平皿，置 35 ℃、含 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，挑取巧克力平皿上圓形透明或半透明、濕潤、邊緣整齊的可疑流感嗜血桿菌菌落，接種于巧克力平皿上，35 ℃、5% CO2孵育24 h。24 h后采用質(zhì)譜儀鑒定分純菌株，置信區(qū)間在99.0%～99.9%內(nèi)可鑒定為流感嗜血桿 菌。

1.2.2 藥敏試驗 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對9 種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗，并按照2017年美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀[4]。β內(nèi)酰胺酶檢測采用頭孢硝噻吩紙片刮取平皿上少量菌落，若1 min內(nèi)紙片變紅則為產(chǎn)酶陽性，若不變紅則為陰性。

1.2.3 統(tǒng)計分析 使用WHONET 5.6和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2.1.1 性別、年齡分布 分離的1 320株流感嗜血桿菌中，分離自男性患兒735株（55.7%），女性患兒585株（44.3%）。分離自1歲以下嬰兒510株（38.6%），1～3歲534株（40.5%），4～6歲157株（11.9%），7～16歲119株（9.0%）。

2.1.2 門診和住院患者分布 1 320株流感嗜血桿菌分離自住院患者為92.0%（1 214/1 320），106株分離自門診患者（8.0%），且主要分離自女性患兒陰道分泌物，占83.0% （88/106）。

2.1.3 季節(jié)分布 流感嗜血桿菌主要在冬春季流行，共分離907株，占全年1 320分離株的68.7%，其次為夏季，246株（18.6%），而秋季最少，為167株（12.7%）。見圖1。

2.1.4 標(biāo)本類型分布 檢出的1 320株流感嗜血桿菌主要來自痰液標(biāo)本（痰標(biāo)本由吸痰器吸得且涂片合格），占90.1% （1 189/1 320），其次為陰道分泌物，占6.7%（88/1 320）。此外，肺泡灌洗液13株（1.0%），膿液標(biāo)本20株（1.5%），血液標(biāo)本6株（0.5%），腦脊液和尿液標(biāo)本各2株，分別占0.2%。其中血和腦脊液標(biāo)本同時分離出流感嗜血桿菌1例，陰道分泌物和尿液標(biāo)本同時檢出者2 例。

2.2 β內(nèi)酰胺酶檢測和藥敏試驗

2.2.1 β內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果 剔除同一患者不同部位重復(fù)菌株后，分離的1 317株流感嗜血桿菌中，β內(nèi)酰胺酶陽性株733株，占55.7%，β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥株（β-lactamase-negative and ampicillin-resistant，BLNAR）89株，占6.8%（89/1 317）。

圖1 流感嗜血桿菌季節(jié)分布情況Figure 1 Seasonal distribution of Haemophilus infl uenzae isolates

表1 2018 年1 317 株兒童流感嗜血桿分離株菌對抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 1 Antimicrobial susceptibility of 1 317 Haemophilus inf luenzae isolates from children in 2018（%）

2.2.2 藥敏試驗結(jié)果 分離菌株對抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表1。未檢出對第三代頭孢菌素、美羅培南、左氧氟沙星不敏感的流感嗜血桿菌。

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，使用χ2檢驗比較β內(nèi)酰胺酶陽性氨芐西林耐藥組（β-lactamase-positive and ampicillin-resistant，BLPAR）、β內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林敏感組（β-lactamase-negative and ampicillinsensitive，BLNAS） 以及BLNAR組藥物敏感率，發(fā)現(xiàn)三者對阿莫西林-克拉維酸（χ2= 258.0，P＜0.01）、頭孢呋辛（χ2=180.5，P＜0.01）、阿奇霉素（χ2= 143.0，P＜0.01）、甲氧芐啶-磺胺甲唑（χ2=19.9，P＜0.01）耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意 義。

3 討論

本研究顯示2018年我院兒童患者流感嗜血桿菌的分離株較多，計1 320株，較2017年（837例）有所升高。分析原因如下：①門診標(biāo)本送檢數(shù)量有所增加，尤其是女童陰道分泌物標(biāo)本。近年來，我院患兒陰道分泌物流感嗜血桿菌檢出率有所提高，門診醫(yī)師逐漸意識到陰道分泌物標(biāo)本送檢的重要性。2018年流感嗜血桿菌占門診兒童陰道分泌物主要分離菌第1位。此外，住院患兒痰標(biāo)本中流感嗜血桿菌的檢出率也有大幅提升；②臨床醫(yī)師微生物標(biāo)本的送檢意識提高，對標(biāo)本采集要求也有了一定認(rèn)識，特別是盡量在抗菌藥物使用前送檢標(biāo)本；③對本室工作人員加強(qiáng)培訓(xùn)，提高了微生物室人員對流感嗜血桿菌鑒別分離的能力；④本室選擇多家培養(yǎng)基進(jìn)行比對試驗，采用流感嗜血桿菌生長最佳的巧克力培養(yǎng)基，使流感嗜血桿菌的初篩分離率得到顯著提高；⑤對腦脊液常規(guī)檢測的異常標(biāo)本除采用腦脊液培養(yǎng)瓶培養(yǎng)外，將離心后的沉淀物接種至血平皿及巧克力平皿培養(yǎng)，此外，對于鏡下形態(tài)高度懷疑流感嗜血桿菌或血培養(yǎng)檢出流感嗜血桿菌但腦脊液未報陽者及時向腦脊液培養(yǎng)瓶中添加新鮮血液，提高了腦脊液流感嗜血桿菌的檢出率。

本研究中男性患兒流感嗜血桿菌感染所占比例稍高于女性患兒，提示男性兒童可能較易受該菌感染，與甄楊等[5]、程薇等[6]的報道結(jié)果一致。年齡分布顯示，我院流感嗜血桿菌感染患兒以3歲以下嬰幼兒為主，占79.1%，可能與其肺功能及免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全有至關(guān)重要的關(guān)系。因此，需要及時接種流感嗜血桿菌疫苗，預(yù)防流感嗜血桿菌感染的發(fā)生。多個研究顯示，流感嗜血桿菌感染呈明顯的季節(jié)性分布，好發(fā)于冬春季[7-8]。本組資料顯示，我院冬春季共檢出907株流感嗜血桿菌，占全年分離株的68.7%，可能與北方冬春季寒冷空氣使兒童黏膜局部免疫受損有關(guān)。

流感嗜血桿菌是條件致病菌，常定植于正常人鼻咽部，以學(xué)齡前兒童的定植率最高，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時，可侵入下呼吸道引起感染[9]。本研究顯示流感嗜血桿菌主要分離自下呼吸道，其中痰標(biāo)本最多，占總分離株的90.1%（1 189/1 320），肺泡灌洗液共檢出13株。陰道分泌物是除呼吸道標(biāo)本外比率較高的標(biāo)本類型，共分離出88株，占總分離株的6.7%?；純耗挲g范圍為7個月齡～11歲，主要集中在3～7歲學(xué)齡前兒童。有國外報道稱流感嗜血桿菌是引起青春期前女孩外陰陰道炎的最常見致病菌[10]，國內(nèi)盧文敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌占陰道炎患兒陰道分泌物分離株的第2位，僅次于大腸埃希菌。本研究顯示，我院兒童陰道分泌物培養(yǎng)的致病菌中，流感嗜血桿菌的檢出率居首位，與鐘華敏等[12]結(jié)果一致。中耳炎、外科創(chuàng)傷等膿性分泌物中所占比例僅次于陰道分泌物，占1.5% （20/1 320）。值得關(guān)注的是，尿液標(biāo)本共檢出2例，且這2例患兒陰道分泌物均檢出流感嗜血桿菌。

氨芐西林曾是治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥率逐漸升高，耐藥程度也日益嚴(yán)重[3]。本組資料顯示2018年我院流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率高達(dá)62.5%。目前，公認(rèn)的流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥機(jī)制主要有兩種，其中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是其最常見的作用機(jī)制[13]。非產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥可由ftsI基因點突變影響青霉素結(jié)合蛋白（PBP），使PBP對抗生素的親和力降低，此種耐藥株稱為BLNAR株[14]，本研究檢出89株，僅占6.8%（89/1 317），提示我院2018年流感嗜血桿菌對氨芐西林的耐藥機(jī)制仍以產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶為主，氨芐西林已不再適合作為治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。此外，統(tǒng)計分析顯示β內(nèi)酰胺酶陽性菌株對阿莫西林-克拉維酸、頭孢呋辛、阿奇霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑的敏感率明顯低于β內(nèi)酰胺酶陰性菌株。

本研究數(shù)據(jù)顯示流感嗜血桿菌對頭孢呋辛的耐藥率為32.3%，較2017年（29.5%）和2016年（27.5%）有所上升。這一結(jié)果提示對于部分輕中度感染的患兒在第二代頭孢菌素類抗生素經(jīng)驗用藥前應(yīng)及時送檢疑診感染部位的標(biāo)本，同時應(yīng)密切注意患兒的體征改變和臨床微生物室檢驗報告，轉(zhuǎn)為目標(biāo)治療。阿莫西林-克拉維酸作為常用的口服抗生素，細(xì)菌對其敏感率較高，為92.8%，罕見對頭孢曲松、頭孢噻肟不敏感株，敏感率達(dá)100%，說明我院流感嗜血桿菌分離株對第三代頭孢菌素和含酶抑制劑的復(fù)合制劑保持較高敏感率，可作為經(jīng)驗性治療的首選藥物。此外，未發(fā)現(xiàn)對美羅培南的不敏感株，提示碳青霉烯類對流感嗜血桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，但并不主張將其作為治療的首選藥物，以避免抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。所有菌株中未見左氧氟沙星的不敏感菌株，這可能與兒童患者因用藥安全問題很少選擇該種抗菌藥物有關(guān)。分離株對阿奇霉素的非敏感率為28.8%，敏感率為71.2%，與CHINET 2017年兒童株流感嗜血桿菌阿奇霉素26.1%的非敏感率較為接近[15]。在所有抗菌藥物中對甲氧芐啶-磺胺甲唑的耐藥率最高，達(dá)67.0%，臨床不宜選用。

綜上所述，我院流感嗜血桿菌菌株主要來自下呼吸道，3歲以下嬰幼兒為易感人群，冬春季為感染高發(fā)季節(jié)。菌株對氨芐西林的高耐藥率與β內(nèi)酰胺酶高產(chǎn)酶率有關(guān)，使得氨芐西林已不能作為臨床一線用藥。臨床醫(yī)師在經(jīng)驗性治療時可首選第二代、第三代頭孢菌素和加酶抑制劑的復(fù)合制劑，但因第二代頭孢菌素如頭孢呋辛的耐藥率有逐年上升的趨勢，應(yīng)在用藥前盡快送檢患兒可疑感染部位的標(biāo)本并及時根據(jù)微生物室提供的藥敏結(jié)果合理選擇抗菌藥物。這樣不僅有利于患者療效的提高，也利于控制臨床耐藥菌株的增長速度。