摘?要：在生物實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒DNA常常作為基因載體運(yùn)載工具使用，應(yīng)用非常廣泛，質(zhì)粒DNA的提取通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，保證其提取的效率和質(zhì)量對(duì)生物實(shí)驗(yàn)研究具有重要意義，基于此本文對(duì)質(zhì)粒DNA的提出方法進(jìn)行了探討。

關(guān)鍵詞：質(zhì)粒DNA;提取方法;研究

質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，當(dāng)前通常用其來(lái)特指細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程領(lǐng)域，質(zhì)粒常常被當(dāng)做基因的載體使用。在分子生物學(xué)中，質(zhì)粒DNA被當(dāng)做基因運(yùn)載工具具有非常廣泛的應(yīng)用。在質(zhì)粒DNA的應(yīng)用過(guò)程中，其純度對(duì)于酶切、PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著比較大的影響，因此需要保證質(zhì)粒DNA提取的純度和效率。

在細(xì)菌中提取質(zhì)粒DNA通常按照以下步驟進(jìn)行：第一步，培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒擴(kuò)增;第一步，進(jìn)行細(xì)菌的收集和裂解;第三步，質(zhì)粒DNA的分離和純化。在質(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中，其提取效果和其大小呈現(xiàn)出正比例關(guān)系，越小越容易進(jìn)行提取，這主要是由于，如果質(zhì)粒DNA比較大的話，其特性機(jī)會(huì)和染色體DNA比較接近，這樣想要將二者分離開(kāi)來(lái)難度就會(huì)變大。在進(jìn)行質(zhì)粒DNA的分離時(shí)，適宜的條件是非常重要的，主要包括pH值、SDS濃度、時(shí)間和溶菌溫度等，在適宜的條件下質(zhì)粒DNA和染色體DNA才能夠更好的分離開(kāi)來(lái)。細(xì)菌濃度對(duì)于質(zhì)粒DNA的提取也是非常重要的，如果細(xì)菌的濃度比較高，那么在溶菌時(shí)，溶菌液很難和細(xì)菌液充分混合，導(dǎo)致溶菌不徹底的問(wèn)題，這樣會(huì)造成質(zhì)粒的回收率比較低;而如果細(xì)菌溶度比較低，溶菌液和菌液均分混合，會(huì)造成溶液中含有較多的蛋白質(zhì)、染色體以及菌體碎片，在這樣的情況下，沉淀時(shí)質(zhì)?；睾线@些物質(zhì)共沉，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)粒的回收率也會(huì)比較低。在生物學(xué)的相關(guān)研究之中，細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取是比較常規(guī)的技術(shù)和操作，主要的方法有堿裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面對(duì)這些方法的最新研究進(jìn)行介紹。

1 堿裂解法

堿裂解法是當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的質(zhì)粒DNA提取方法，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于提取的質(zhì)粒DNA純度高，操作便捷，缺點(diǎn)是需要較長(zhǎng)的提純時(shí)間。研究人員在縮短這一方法的提純時(shí)間方面做了大量的研究，但是沒(méi)有得到理想的效果，當(dāng)前這一方法提取DNA的時(shí)間都在1.5h以上。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的基本原理：首選，在菌液中加入溶液Ⅰ，使細(xì)菌細(xì)胞懸浮，同時(shí)其中的EDTA會(huì)和Ca2+以及Mg2+螯合，起到抑制DNase活性的作用;然后，加入溶液Ⅱ，將細(xì)胞裂解，在這個(gè)過(guò)程中蛋白質(zhì)和少量質(zhì)粒將會(huì)變質(zhì);再次，加入溶液Ⅲ，使多數(shù)蛋白質(zhì)以及染色體DNA被沉淀，并使得質(zhì)粒DNA復(fù)性。其中，該方法中起到裂解細(xì)菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH，正因如此該方法被稱為堿裂解法，如果將其換為SDS，也能夠提取出少量的質(zhì)粒DNA，這是由于SDS也是堿性的，可以一定程度上破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜。在這一方法中需要注意，NaOH溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配，這個(gè)主要是由于其能夠和空氣中的CO2反應(yīng)，從而使溶液的堿性降低，這樣會(huì)影響提純的效率，另外在加入溶液Ⅱ之后，操作時(shí)間不能夠過(guò)長(zhǎng)，這是因?yàn)槿旧wDNA在堿性條件下片段會(huì)慢慢斷裂。另外需要注意的是，在操作過(guò)程中，混勻是一定要輕柔，從而在保證細(xì)菌沉淀可以充分的擴(kuò)散在試劑中的前提下，避免已變性質(zhì)粒DNA和染色體基因組DNA被機(jī)械剪切。此外，在溶液Ⅲ加入之后，其中的SDS會(huì)和蛋白質(zhì)結(jié)合，會(huì)產(chǎn)生大量的沉淀，SDS還會(huì)和醋酸鉀結(jié)合，生成PDS，這一物質(zhì)的溶解度遠(yuǎn)低于SDS，從而可以將大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA共沉淀。

2 煮沸法

煮沸法的優(yōu)點(diǎn)在于，能夠在高菌體濃度的條件下進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，應(yīng)用這種方法可以是菌體裂解液濃度達(dá)到OD600等于100，能夠達(dá)到堿裂解法的2.5倍。在進(jìn)行質(zhì)粒的提取時(shí)，提高提取效率十分重要，因此需要更提高處理樣品的能力。在提取時(shí)，同一時(shí)間內(nèi)，最好處理盡可能多的菌體，而菌體濃度比較高的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致裂解不充分的問(wèn)題，并增加后續(xù)操作的難度，影響到質(zhì)粒DNA的提取效率和質(zhì)量。通過(guò)煮沸法則可以有效的解決這一問(wèn)題，這是特點(diǎn)也是煮沸法的主要優(yōu)勢(shì)所在。在傳統(tǒng)的煮沸法中，裂解通常在100℃的熱水浴中進(jìn)行，如果溫度過(guò)高的話，不僅難以控制好溫度，同時(shí)會(huì)浪費(fèi)比較多的能源。研究人員對(duì)煮沸法進(jìn)行了優(yōu)化，在連續(xù)熱裂解方法中，增加了37℃溫浴這一步驟，在熱裂解之前先37℃溫浴20min，在這樣的條件下，裂解緩沖液中的溶菌酶以及Triton-X100可以充分的和菌體進(jìn)行通，在這樣的條件下，可以降低熱裂解的溫度，只需要70℃就可以滿足要求，溫度更加容易控制，而且能夠節(jié)約能源。

3 SDS裂解法

SDS裂解法中，需要應(yīng)用到3種裂解溶液，每種溶液的作用各不相同。其中，溶液Ⅰ的作用是對(duì)反應(yīng)的pH值進(jìn)行控制，通過(guò)控制pH值來(lái)使細(xì)胞壁溶解，從而增加細(xì)胞比重，從而使細(xì)胞懸浮起來(lái);溶液Ⅱ的主要作用是使長(zhǎng)鏈基因組DNA變性，并使其和蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片等相互纏繞，最終形成大型的復(fù)合物，SDS會(huì)將這一復(fù)合物包覆起來(lái)，在這一過(guò)程中部分超螺旋的閉環(huán)環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)出現(xiàn)可逆變性;在加入溶液Ⅲ之后，該溶液能夠使整個(gè)系統(tǒng)恢復(fù)中性條件，從而使出現(xiàn)可逆變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，同時(shí)接入溶液Ⅲ后，SDS還會(huì)和其中的醋酸鉀出現(xiàn)反應(yīng)，生成溶解度較低的PDS，從而使SDS包覆的大型復(fù)合物沉淀，離心之后就可以分離出質(zhì)粒DNA。

4 結(jié)論

堿裂解法、煮沸法和SDS裂解法是比較常規(guī)的質(zhì)粒DNA提取方法，其中，堿裂解法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，提出的質(zhì)粒DNA純度較高，具有較高的提取效率，因此應(yīng)用的比較廣泛，應(yīng)用此方法提取出的質(zhì)粒DNA被廣泛應(yīng)用轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酶切分析以及DNA重組實(shí)驗(yàn)中;煮沸法則由于過(guò)程比較劇烈，容易導(dǎo)致質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的破壞，其優(yōu)點(diǎn)是可以處理高濃度的菌液;SDS裂解法具有良好的提出純度。

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作者簡(jiǎn)介：王佩菡（1997-），女，回族，山東濟(jì)寧人，本科三年級(jí)，研究方向：健康科學(xué)。