楊萬娟，徐杰

(昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周病科，昆明 650106)

近年來，檢測唾液、菌斑中微生物的高通量測序技術被廣泛應用于口腔內多種疾病的研究，并取得了一定進展[1-3]。牙周炎是一組臨床表現(xiàn)為慢性炎癥和牙齒周圍支持組織破壞的疾病，始動因素為牙菌斑生物膜。通常牙周菌群之間及其與宿主之間維持著動態(tài)平衡，若牙周微生態(tài)失衡，則牙周炎開始發(fā)生發(fā)展，此時的微生態(tài)環(huán)境和微生物群落組成較牙周健康時更復雜。牙周炎是感染性疾病，但其與病因學有關的微生物成分和宿主反應成分尚未完全明確，因此，對與牙周炎相關菌種進行分類，并對牙菌斑生物膜中微生物之間的關系進行闡述，有助于理解微生物之間的聯(lián)系及致病機制[4]。高通量測序技術的發(fā)展使群落組成和結構成為牙周微生物研究的新方式之一，可用于牙周炎、種植體周圍炎相關微生物的研究，該技術憑借高通量、高效率和高準確度的優(yōu)勢，能夠全面細致地了解牙周微生物群落的組成和結構，有利于更好地理解牙周微生物之間的相互關系，并能從復雜的微生物群落中尋找優(yōu)勢菌群，探索牙周炎與全身疾病之間的關系，指導臨床診斷及疾病防治，為牙周病的病因學發(fā)展提供幫助[5-7]?，F(xiàn)對高通量測序技術的原理、特點及其近年來在牙周微生物群落中的研究及應用予以綜述。

1 牙周微生物

口腔中有超過500種微生物定植在齦下菌斑生物膜中，組成了復雜的牙周微生態(tài)環(huán)境[8]。其中大部分細菌為口腔正常菌群，僅牙周致病菌具有顯著的毒力。當前公認的牙周致病菌主要有11種：牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、福賽坦氏菌(Tannerela forsythia，Tf)、齒垢密螺旋體、伴放線聚集桿菌、直腸彎曲菌、纏結優(yōu)桿菌、聚核梭桿菌、中間普式菌(Prevotella intermedia，Pi)、變黑普式菌(Prevotella nigrescens，Pn)、微小微單胞菌和中間鏈球菌。研究表明，牙周機械治療后，牙周致病菌較臨床指標的變化更早[9]，因此牙周微生物的檢測對疾病的治療與預后評估有指導意義。然而，與典型細菌感染不同，在大多數(shù)牙周炎病例中，隨著疾病的發(fā)展，微生物群落的多樣性也會增加。復雜的微生物群落使針對某個特定牙周致病菌的治療難以達到治療目的[10]，牙周病的治療目標不是消除口腔微生物群落，而是選擇性地支持有益菌種的生長，并減緩菌斑生物膜的生長和新陳代謝，減少牙周微生態(tài)失調的發(fā)生[11]。因此，選擇合適的方法檢測牙周微生物，了解群落的組成和多樣性，有助于進一步探索牙周微生物之間的相互作用，并為疾病的治療和預防提供參考。

2 高通量測序技術

2.1原理 高通量測序技術通過引物延伸、檢測新加入核苷酸、以化學或酶的方法清除反應底物或熒光源等一系列重復步驟進行測序，同時檢測每個片段群進行反應所產生的信號，“大規(guī)模并行測序”可以使數(shù)十萬乃至數(shù)億個測序反應同時進行并被同步檢測[12]。因此，該技術能夠一次檢測成百上千萬的基因序列，并通過完整的序列信息，全面細致地對基因組進行測序[13]。

2.2特點 高通量測序技術具有高輸出量與高解析、高效率和高精確度的特點[14]。與細菌培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)等檢測技術相比，高通量測序技術可以一次性同時檢測多種微生物，高效省時。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法是微生物檢測的“金標準”，但培養(yǎng)技術和條件復雜，存在一定的局限性[15]。目前，不依賴細菌培養(yǎng)的PCR等技術被廣泛應用于牙周微生物的研究，PCR技術可以對一種或幾種已知的牙周致病菌進行詳細的檢測，探究它們與臨床指標之間的相關性，但僅通過PCR技術同時檢測的細菌有限，而牙周微生物群落復雜多樣，細菌之間存在協(xié)同或拮抗作用，單純檢測某種細菌無法全面反映各細菌之間的相互作用，因此對微生物群落整體進行研究顯得尤為重要[16-17]。隨后，研究者開始通過PCR變性梯度凝膠電泳技術分析牙周微生物群落的組成結構，并初步認識群落結構，但圖譜的條帶容易出現(xiàn)多種細菌混雜的現(xiàn)象，識別細菌的分辨率較低[18-19]。在微生物檢測方面，上述技術僅能檢測保守區(qū)已知的微生物基因序列，當微生物的基因發(fā)生重組突變或者需要檢測未知的微生物時，這些技術就無法發(fā)揮作用。與上述傳統(tǒng)檢測技術相比，高通量測序技術不僅能夠同時檢測多種微生物的基因組序列，對微生物進行定性及定量，還能檢測低豐度甚至痕量菌種，并可發(fā)現(xiàn)未知微生物。但高通量測序技術費用昂貴，在樣本處理階段，該技術對樣本DNA的純度及濃度要求較高[20]；在生物信息分析階段，由于受到測序平臺讀長、物種數(shù)據(jù)庫和物種分類軟件等的影響，該技術對種水平分類學信息的置信度較低[21]。

3 高通量測序技術與牙周微生物群落研究

由于牙周病是多種微生物混合感染性疾病，而高通量測序技術具有高通量、高效率和高準確度的特點，能夠較全面地對牙周微生物群落的組成和結構進行研究，因此，近年來學者們將高通量測序技術用于牙周微生物的檢測，并取得了一定的進展。高通量測序技術在牙周微生物檢測中的應用使牙周微生物的研究從以往單一特定的菌種研究向群落整體研究轉變。高通量測序技術在牙周微生物群落研究中的應用主要包括以下幾方面。

3.1牙周炎相關菌群的檢測 高通量測序技術能夠明確牙周組織在健康或疾病狀態(tài)下的菌群組成和結構差異，并從微生態(tài)角度更具體的檢測導致牙周微生態(tài)失調的菌群，對于了解牙周炎的發(fā)病機制并明確牙周疾病的診斷具有重要作用。在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)和螺旋體門(Spirochaetes)等是牙周炎的優(yōu)勢菌門，變形菌門(Proteobacteria)是牙周健康者的優(yōu)勢菌門，而厚壁菌門是牙齦炎中的優(yōu)勢菌門[22-23]。在屬水平上，鏈球菌屬(Streptococcus)在牙周健康者中占主導地位，而牙周炎中的優(yōu)勢菌屬主要包括普氏菌屬(Prevo-tella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和密螺旋體屬(Treponema)等[5]，它們均是革蘭陰性專性厭氧菌，在齦下菌斑生物膜的定植過程中發(fā)揮重要作用。上述研究通過高通量測序技術分別從細菌學的不同分類級別對牙周微生物群落的輪廓進行了詳細的描繪，并從更全面的微生態(tài)角度證實了牙周健康者與牙周病患者菌群之間的區(qū)別，使復雜的牙周微生物群落更加形象具體，了解微生物在不同生態(tài)環(huán)境中的相互作用，也為進一步確認牙周優(yōu)勢菌提供了更多的可能。

隨著牙周炎的進展，疾病可分為輕、中、重度，而探診深度(probing depth，PD)可在一定程度上反映牙周炎的進展狀況，因此對不同PD牙周袋內微生物的相應研究能為牙周炎的治療及預防提供幫助。研究發(fā)現(xiàn)，淺牙周袋(PD≤3 mm)與深牙周袋(PD≥6 mm)內的菌群存在明顯差異，放線菌門(Actinobacteria)在深袋內檢出率高，淺袋和深袋內的微生物可能還受不同種族、牙位以及吸煙等因素的影響[24-25]。Shi等[20]的研究表明，隨著PD的增加，侵襲性牙周炎或慢性牙周炎的細菌豐度均發(fā)生改變，某些細菌還與牙周袋深度呈線性相關，慢性牙周炎中與PD呈正相關的有Porphyromonas、產線菌屬和支原體等，侵襲性牙周炎中與PD呈正相關有棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯菌屬等，但在兩種牙周炎中某些細菌的變化趨勢不同，有時甚至相反，如Corynebacterium，表明不同牙周炎進展階段的優(yōu)勢菌群也不同，與以往研究某種細菌的致病性不同，通過測序了解細菌在疾病發(fā)生發(fā)展中的微生物群落的變化，有助于通過調控微生態(tài)平衡控制牙周疾病。

高通量測序技術將為深入探究微生物的致病機制提供方向。除了分析牙周炎微生物群落的組成和結構外，高通量測序技術還可以通過分析微生物群落結構的差異推斷微生物間的親緣關系，進行群落功能差異分析。通過測序可以預測包括膜轉運、復制和修復、糖代謝、氨基酸代謝及能量代謝等在內的許多細菌代謝功能[26]。Wang等[27]研究亦發(fā)現(xiàn)，在牙周微生物群落中，與調控細菌趨化和多糖生物合成有關的許多功能基因和代謝途徑呈過表達。Li等[28]通過454焦磷酸測序對來自中國的10例侵襲性牙周炎患者及其直系親屬的微生物群落進行分析，結果顯示，家庭成員間微生物群落的組成更加相似，說明中國人侵襲性牙周炎及家屬的微生物群落系統(tǒng)發(fā)育結構存在親緣關系，提示中國家庭共用餐具和父母咀嚼喂養(yǎng)嬰兒等飲食習慣可能在一定程度上造成牙周微生物在家庭成員間的傳播。

與傳統(tǒng)檢測方法相同，高通量測序可以檢測主要的牙周致病菌[29]。研究發(fā)現(xiàn)，Pi和Pn可能是齦下菌斑中的“關鍵物質”，能反映齦下微生態(tài)系統(tǒng)中微生物和環(huán)境的動態(tài)變化，提示可將它們作為預測牙周炎的新的生物標志物[30]。與傳統(tǒng)檢測方法不同，除檢測已知的牙周致病菌外，測序還能檢測與牙周炎相關的可疑致病菌，發(fā)現(xiàn)新菌種[31]。Torres等[32]通過測序發(fā)現(xiàn)了一種新型牙周病相關細菌，該細菌屬于擬桿菌屬，暫命名為CBP(Candidatus Bacteroides periocalifornicus)，主要存在于深牙周袋中，與紅色復合體的關系密切，促使了牙周炎病因學研究的進一步發(fā)展。

3.2牙周基礎治療前后菌群變化的檢測 牙周基礎治療是所有牙周病患者的必經治療，旨在消除大部分致病及危險因素，進而控制炎癥，穩(wěn)定病情。通過高通量測序觀察基礎治療前后牙周菌群的變化有助于進行療效評估。Shi等[33]使用宏基因組鳥槍測序，描述了牙周炎患者基礎治療前后齦下微生物組的動態(tài)變化，揭示了病原微生物之間的協(xié)同作用對疾病發(fā)生發(fā)展的影響，并提出齦下微生物組可作為疾病診斷和預后的潛在指標。牙周基礎治療后減少的菌群主要是Bacteroidetes、Spirochaetes、Fusobacteria、Pg、Tf和Pi等牙周致病菌，顯著增加的菌群主要是Actinobacteria、Proteobacteria、Streptococcus等有益菌[29,34]，提示牙周基礎治療可以明顯改變牙周微生物群落的構成，輔助使用抗生素能夠顯著降低菌群豐度[35]。Laksmana等[36]通過檢測基礎治療前后的菌群變化發(fā)現(xiàn)，齦下菌群的特征是由少數(shù)物種主導的高物種豐度的微生物群落，高通量測序適用于評估牙周微生物群的復雜性和變化。牙周炎是一種靜止期和活動期交替發(fā)展的疾病，如何確定治療的有效性，并以此作為依據(jù)制訂治療策略是牙周治療成功的關鍵。相較于其他僅能分析單一種或幾種細菌的傳統(tǒng)檢測法，采用高通量測序技術能夠更全面地分析牙周微生物群的復雜性和變化，可為臨床醫(yī)師的治療選擇提供更多參考。

3.3伴全身性疾病的牙周炎相關菌群的檢測 牙周炎與心血管疾病、糖尿病及IgA腎病等多種全身性疾病有關。研究證明，動脈粥樣硬化斑塊中存在口腔微生物的定植，且動脈粥樣硬化伴牙周病患者血管內皮中細菌類群顯著高于單純動脈粥樣硬化患者[37]。Saeb等[7]通過測序發(fā)現(xiàn)，糖尿病及糖尿病前期患者的牙周微生物群落的生物和系統(tǒng)發(fā)育多樣性明顯低于血糖正常者，該研究結果可能有助于更好地理解牙周炎與糖尿病之間的雙向關系。有學者提出，齦下微生物群或許可用于預測慢性牙周炎患者IgA腎病的發(fā)病率，由于伴有IgA腎病的慢性牙周炎患者的齦下微生物多樣性略高于無IgA腎病的慢性牙周炎患者，且齦下微生物結構的變化與慢性牙周炎患者的IgA腎病發(fā)病率之間存在相關性[38]。可見，牙周炎與全身性疾病相關，但尚無關于系統(tǒng)性疾病發(fā)病機制中微生物和炎癥作用的確切結論，測序通過描繪具體的菌群輪廓可能有助于更深入地認識全身性疾病與牙周炎的關系，為患者提供更個性化的診療。

3.4種植體周圍炎相關菌群的檢測 種植體周圍炎也是以菌斑生物膜為始動因子的疾病。若不進行定期維護，5年內種植體周圍炎的發(fā)生率為43.9%[39]，了解種植體周微生物群落組成和結構，有利于進行種植體周圍黏膜炎與種植體周圍炎的預防與治療。種植體周圍炎的部位與健康部位的微生態(tài)系統(tǒng)不同，Synergistetes與種植體周圍炎高度相關[40]。Sanz-Martin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，種植體周圍炎的菌群具有共生體缺失、致病菌富集、傳統(tǒng)致病菌和新致病菌并存的特點，且種植體周圍炎的核心微生物群是牙周炎相關菌屬的一個類群，這些菌群特點只有通過測序才能被發(fā)現(xiàn)，若通過測序了解其特點及相互作用，并在此基礎上選擇性地促進有益菌的生長，可能將為種植體相關疾病的治療提供幫助。

4 小 結

牙周病是多種微生物混合感染性疾病，隨著牙周微生物檢測技術的發(fā)展，關于牙周病的病因學研究也不斷發(fā)展。高通量測序技術的發(fā)展使牙周微生物的研究不僅僅局限于檢測某種特定的牙周致病菌，而是在不同層次牙周微生態(tài)細菌分類學的基礎上認識牙周微生物群落的組成和結構，了解微生物在牙周病及種植體周圍相關疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示牙周病與全身性疾病之間的關系，為疾病的預防及治療提供參考。高通量測序技術能夠進行全面的牙周微生物群落研究，而常用PCR等技術則可以在此基礎上對已經篩選出的微生物群落中的特定菌種展開研究，各種微生物檢測技術之間相互補充，也為牙周病的病因學研究提供了更多可能。