凌昊楠，李松軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院骨一科，廣東 珠海 519100)

關(guān)節(jié)軟骨在多種情況下均會受到損傷，如關(guān)節(jié)軟骨病、骨性關(guān)節(jié)炎以及創(chuàng)傷等，給患者帶來痛苦和不便[1]。由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏營養(yǎng)供應(yīng)，損傷后幾乎無法自我修復(fù)，而傳統(tǒng)的治療方法(如微骨折術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù))修復(fù)的是纖維軟骨，與周圍正常軟骨不同，因此療效不佳[2]。目前，越來越多的研究認(rèn)為，軟骨下骨在修復(fù)軟骨缺損中起重要作用，軟骨修復(fù)觀念從單純的軟骨修復(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)楣擒浌且惑w化修復(fù)[3]。近年來醫(yī)療技術(shù)發(fā)展迅速，組織工程技術(shù)使用“支架+種子細(xì)胞+細(xì)胞因子”作為新型的治療理念更是得到了廣大醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)同[4]。而支架又是組織工程的重中之重，以往的支架制作方法(如氣體發(fā)泡、溶劑澆筑、熔化鑄造[5])因難以制備多種結(jié)構(gòu)特異的個性化支架而在實(shí)際應(yīng)用中受到了較大限制，隨著3D打印技術(shù)的出現(xiàn)，一種與傳統(tǒng)材料加工方法完全不同的制造方式出現(xiàn)，其可以精確控制支架的尺寸和特性[6]，并能最大限度符合個體的需求。同時，在支架材料選擇方面，目前的單一材料在不同方面均存在一定弊端，很難滿足理想支架的屬性，因此越來越多的研究將不同材料混合打印復(fù)合支架，盡可能地滿足理想的支架屬性[7]?，F(xiàn)就3D打印復(fù)合支架修復(fù)軟骨缺損的研究進(jìn)展予以綜述。

1 理想支架的屬性

1.1可降解性及孔隙設(shè)計(jì) 一般而言，理想的組織工程支架由可生物降解的材料組成，且具備高孔隙率，高孔隙率的設(shè)計(jì)使細(xì)胞易于附著、增殖和分化，同時可提高細(xì)胞活力，使其更易在支架內(nèi)生長[8]。在缺乏血液營養(yǎng)的情況下，相互連接的孔隙結(jié)構(gòu)可促進(jìn)氧氣向組織內(nèi)部擴(kuò)散并提供營養(yǎng)物質(zhì)，且有助于代謝廢物排出；多孔隙性還可支持細(xì)胞向支架內(nèi)遷移生長，增加細(xì)胞與支架附著和相互作用的最大表面積，為細(xì)胞生長提供良好的環(huán)境[9]?？啥ㄖ瓶紫兜拇笮∫彩抢硐胫Ъ艿奶攸c(diǎn)之一，已有研究證明，支架的孔隙密度和尺寸大小對細(xì)胞的生長和黏附具有重要意義[10]。孔隙尺寸減小，支架的整體有效表面積將增加，這會使支架本身的可用性增加，但需注意的是，過小的孔徑可能很難使細(xì)胞黏附在支架上[11]。因此，需要精確的孔隙設(shè)計(jì)使細(xì)胞更好地黏附并生長于支架上，形成支架復(fù)合物，最后隨著支架材料由外到內(nèi)逐漸收縮降解，促進(jìn)宿主細(xì)胞作用于組織缺損處而發(fā)揮作用。

1.2生物相容性 由于組織工程支架制備有細(xì)胞參與，并需要在植入活體內(nèi)發(fā)生作用，因此制作支架的材料不得含有任何導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡的細(xì)胞毒性元素，且容易從體內(nèi)排出，其引起的免疫反應(yīng)也應(yīng)盡可能達(dá)到可忽略[12]。常見的細(xì)胞毒性來源包括構(gòu)建支架的大分子、光聚合所用的引發(fā)劑、聚合物合成中的有機(jī)溶劑殘留以及聚合物降解產(chǎn)物等，選擇打印材料時必須考慮這些因素。目前有很多方法(如表面改性、堿化處理、表面血清涂層)可提高打印材料的生物相容性[13]。Hosseini等[14]設(shè)計(jì)并改進(jìn)了一種新型纖維支架的制作方法，利用聚乙醇酸作為原材料制作3D支架，并使用聚4-羥基丁酸進(jìn)行表面涂層改性，制作成功后與細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，沿著聚乙醇酸纖維方向的細(xì)胞排列增加。

1.3生長因子 生長因子也是理想的組織工程支架中必不可少的一部分。特定的生長因子和生物分子可以調(diào)節(jié)新生軟骨的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨和軟骨的發(fā)育中起關(guān)鍵作用，具有誘導(dǎo)始祖細(xì)胞分化的能力[15]。同時，生長因子的不同使用劑量對于骨組織的形成發(fā)育也有一定的影響作用，選取最適宜劑量的生長因子可以更精準(zhǔn)地促進(jìn)干細(xì)胞向特定方向增殖分化。要想充分發(fā)揮生長因子的治療潛力，生長因子的載體選擇尤為重要，載體設(shè)計(jì)必須滿足一些特定要求(如提供局部遞送和模擬動態(tài)的天然生長因子表達(dá)水平)和模式[16]。目前已有血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子-1和成纖維細(xì)胞生長因子等生長因子搭配不同載體在骨及軟骨組織工程中成功應(yīng)用的實(shí)例[17]。Cipitria等[18]將定量的BMP負(fù)載醫(yī)用聚己內(nèi)酯磷酸鈣支架置入綿羊脛骨30 mm缺損處，而對照組則單純置入聚己內(nèi)酯磷酸鈣支架，術(shù)后12個月觀察兩組缺損處的新生組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，搭載BMP組的骨缺損修復(fù)效果更顯著，證實(shí)BMP可促進(jìn)新生骨組織的形成。

1.4機(jī)械性能 良好的機(jī)械性能可提供細(xì)胞支撐作用并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并為促進(jìn)細(xì)胞分化提供良好的環(huán)境，是影響骨及軟骨組織生長的關(guān)鍵。支架置入后，可在缺損部位組織修復(fù)前暫時起到替代作用，以達(dá)到理想的細(xì)胞分化結(jié)果，這就要求具有較高的力學(xué)性能，因此選擇與天然骨及軟骨組織相似硬度的支架材料會更加有利[19]。3D打印技術(shù)具備可調(diào)控支架微觀結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，因此可制備出剛度與目標(biāo)組織相匹配的個性化支架，符合理想支架的制備要求。Bahcecioglu等[20]以聚L-乳酸/聚乳酸-乙醇酸為復(fù)合材料制作3D打印支架，并研究支架微結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能對纖維軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞附著、擴(kuò)散和增殖等的影響，結(jié)果顯示，3D微孔支架上的細(xì)胞行為主要受孔徑和支撐剛度的調(diào)節(jié)，細(xì)胞的響應(yīng)取決于細(xì)胞和材料的剛度，證明了機(jī)械性能對理想支架的重要性，有助于設(shè)計(jì)更理想的組織工程支架。

2 3D打印技術(shù)原理分類

3D打印技術(shù)又被稱為快速成型技術(shù)，是當(dāng)前各行各業(yè)研究的熱點(diǎn)，其基本原理是“分層構(gòu)建，逐層疊加”[21]，可以在計(jì)算機(jī)3D模型的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上快速精準(zhǔn)地構(gòu)建復(fù)雜外觀與內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)，并逐層打印出實(shí)體模型，以最大限度地滿足個性化需求。

2.1光固化立體印刷(stereolithography，SLA) SLA簡稱光造型術(shù)，是目前運(yùn)用最廣泛的3D打印技術(shù)。SLA常用的材料為光敏樹脂，包括高光敏性的高分子材料(聚乳酸、脂肪族聚酯等人工合成的高分子以及蛋白質(zhì)、多糖等天然高分子)，液體的光敏聚合物經(jīng)紫外激光照射掃描的定向作用逐漸聚合固化，從而達(dá)到定點(diǎn)固化光敏聚合物建模的目的[22]。雖然SLA可以快速生產(chǎn)具有受控結(jié)構(gòu)和微米級分辨率的支架，但支架成型后需要清洗雜質(zhì)，可能影響原形狀，對制作材料的限制較多，實(shí)際運(yùn)用中的成本較高[23]。Luo等[24]利用SLA技術(shù)以聚富馬酸丙烯酯為原材料制作3D支架，并研究其物理化學(xué)參數(shù)(包裹黏度、聚合物濃度、聚合度和樹脂打印溫度等)對支架力學(xué)性能的影響，最終證實(shí)3D打印聚富馬酸丙烯酯支架具備良好的力學(xué)性能，可以作為骨及軟骨組織工程中的備用支架。

2.2選擇性激光燒結(jié)(selective laser sintering，SLS) SLS使用受計(jì)算機(jī)控制的紅外激光束將粉末狀的材料高溫熔融后實(shí)現(xiàn)黏結(jié)固化，再逐層燒結(jié)形成所需的支架。SLS加工速度快，可創(chuàng)造出機(jī)械性能高的精細(xì)結(jié)構(gòu)支架，但其成型產(chǎn)品表面粗糙，處理過程中易產(chǎn)生粉塵、毒氣等有害氣體，且高溫易引起高分子材料降解或變性，限制了細(xì)胞和其他生物材料與支架的復(fù)合[25]。Saska等[26]運(yùn)用SLS技術(shù)以聚3-羥基丁酸酯為材料制作3D支架，并研究了聚3-羥基丁酸酯支架的外形、孔隙率、熱性能以及力學(xué)性能，結(jié)果顯示，SLS技術(shù)使聚3-羥基丁酸酯支架的燒結(jié)具有層次結(jié)構(gòu)，孔隙相互連通，孔隙率為(55.8±0.7)%，孔徑為500～700 μm，力學(xué)性能良好，可以作為優(yōu)秀的組織工程支架。

2.33D生物打印技術(shù) 傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)首先進(jìn)行干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，將其增殖傳代后接種到預(yù)制支架上，然后在支架上培養(yǎng)細(xì)胞使其黏附生長形成支架復(fù)合物，再結(jié)合不同的生長因子誘使干細(xì)胞向不同組織、不同功能的細(xì)胞分化，以達(dá)到構(gòu)建特定組織的目的[27]。但此方法無法使干細(xì)胞等生物成分均勻分布，存在無法完全仿生正常組織等弊端，很難構(gòu)建復(fù)雜的分層組織結(jié)構(gòu)。3D生物打印技術(shù)作為一種新興技術(shù)，利用活體細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和液態(tài)生物材料等形成的混合“生物墨水”直接打印材料-細(xì)胞一體化支架，以構(gòu)建復(fù)雜的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，但3D生物打印技術(shù)對打印材料“生物墨水”的要求較高，需要具備匹配的打印速度、高分辨率、適宜的細(xì)胞濃度以及“墨水”液滴體積[28]?！吧锬币彩悄壳盁衢T的研究方向，Zhang等[29]使用3D噴墨生物打印技術(shù)以含丙烯?；牡木垡叶妓z和間充質(zhì)干細(xì)胞為“生物墨水”成功打印出生物支架，并證明了支架與細(xì)胞具有良好的生物相容性，可作為理想的組織工程備用支架。

3 3D打印復(fù)合支架材料及其應(yīng)用

3D打印支架的理想材料對于力學(xué)強(qiáng)度、降解產(chǎn)物的性質(zhì)有較高要求，目前常用的打印材料主要包括天然高分子聚合物、人工合成高分子材料以及生物陶瓷三大類[30]。由于單一材料具有機(jī)械強(qiáng)度不足、存在致病性雜質(zhì)以及降解產(chǎn)物不利于骨細(xì)胞成長分化等弊端，因此研究人員嘗試將兩種以上材料混合形成復(fù)合材料，打印組織工程復(fù)合支架。

3.1以膠原蛋白為基礎(chǔ)材料的復(fù)合支架 在組織工程使用的天然聚合物材料中，膠原蛋白是最常用的一種打印材料，已知的膠原蛋白約有29種類型，Ⅰ型膠原蛋白作為正常細(xì)胞外基質(zhì)的一部分，因具有較好的細(xì)胞親和力、免疫反應(yīng)少、可生物降解、刺激細(xì)胞增殖分化等優(yōu)勢，在骨及軟骨組織工程中應(yīng)用廣泛[31]。由于膠原蛋白不具備足夠的機(jī)械強(qiáng)度[32]，因此常結(jié)合其他材料打印復(fù)合支架。已有研究人員將Ⅰ型膠原蛋白作為基礎(chǔ)材料加入其他材料形成混合材料成功打印出復(fù)合支架，如Grigolo等[33]首先使用Ⅰ型膠原蛋白與羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)混合作為打印材料制作出用于修復(fù)軟骨損傷的復(fù)合支架，隨后將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于該復(fù)合支架上進(jìn)行黏附培養(yǎng)，最終形成支架復(fù)合物，體外實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為軟骨細(xì)胞。Duarte Campos等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原蛋白與瓊脂糖混合后的復(fù)合材料可作為優(yōu)秀的3D生物打印油墨基質(zhì)，在結(jié)合細(xì)胞后可利用生物打印技術(shù)打印出適用于軟骨及軟骨下骨修復(fù)再生的復(fù)合支架。

3.2以聚乳酸為基礎(chǔ)材料的復(fù)合支架 聚乳酸是一種常用的熱塑性高分子材料，具有良好的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性、可降解性和可吸收性，目前已被廣泛用于制造螺釘、血管移植物等醫(yī)療器械[35]。但聚乳酸不具備細(xì)胞外基質(zhì)良好的細(xì)胞親和性，細(xì)胞黏附性差[36]，因此在組織工程應(yīng)用中需進(jìn)行一定處理改性或與其他材料結(jié)合成為復(fù)合材料以“取長補(bǔ)短”。王云起等[37]研究表明，經(jīng)氫氧化鈉處理的聚乳酸表面粗糙度由2 nm增加至40 nm，支架表面空隙增多，可顯著提高細(xì)胞的黏附性。Yang等[38]運(yùn)用含聚乳酸、聚己內(nèi)酯以及疏水性修飾的二氧化硅納米粒子混合后進(jìn)行3D打印制作出孔隙率超過98%的復(fù)合支架，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了高孔隙率的支架結(jié)構(gòu)支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和增殖，顯示了良好的生物相容性。

3.3以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)為基礎(chǔ)材料的復(fù)合支架 PLGA屬于人工合成高分子聚合物，是當(dāng)前組織工程支架的熱門研究材料，具有降解率可控、孔隙率較高和毒性反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)，并可以根據(jù)患者情況進(jìn)行個性化定制[39]。但PLGA的非晶體結(jié)構(gòu)具有較低的楊氏模量，對彈性變形不敏感，機(jī)械性能較差，因此常與其他材料混合制作復(fù)合支架。Yang等[40]使用PLGA和HA作為混合材料進(jìn)行3D打印制作出多孔PLGA-HA復(fù)合支架，體外實(shí)驗(yàn)證明，其抗壓強(qiáng)度較單純PLGA支架顯著增加，具有良好的機(jī)械性能，同時PLGA-HA復(fù)合支架較單純PLGA支架更有利于細(xì)胞附著、增殖、擴(kuò)散和成軟骨分化，是優(yōu)秀的組織工程備用支架。Lai等[41]利用鎂粉、PLGA和β-磷酸三鈣混合后作為打印材料，用3D低溫快速成型技術(shù)打印PLGA/β-磷酸三鈣/鎂復(fù)合支架，并將其置入實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)，證實(shí)了PLGA/β-磷酸三鈣/鎂復(fù)合支架具有良好的仿生結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，同時該復(fù)合支架對軟骨生成及血管新生有一定的促進(jìn)作用，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

3.4以HA為基礎(chǔ)材料的復(fù)合支架 HA屬于生物陶瓷的一種，具有優(yōu)秀的生物相容性和生物活性，且骨傳導(dǎo)性能強(qiáng)，常作為軟骨修復(fù)中軟骨下骨修復(fù)的支架材料。但HA剛性不足和降解速率較慢限制了其在組織工程中的應(yīng)用，因而常將HA與其他材料混合制作復(fù)合支架。Yu等[42]將1,6-己二醇-L-苯丙氨酸基聚與HA納米晶混合，通過3D打印制作出孔隙率75%的復(fù)合支架，并在體外接種MC3T3-E1成骨細(xì)胞，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)后最終證明1,6-己二醇-L-苯丙氨酸基聚/HA復(fù)合支架可成功誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖和分化，具有巨大的應(yīng)用潛力。Yao等[43]利用聚己內(nèi)酯與HA混合的復(fù)合材料通過3D打印成功制作出了力學(xué)性能強(qiáng)、可塑性高、生物可降解性良好的復(fù)合支架，該復(fù)合支架可作為軟骨修復(fù)的理想支架。

4 小 結(jié)

3D打印技術(shù)可以根據(jù)受損部位的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出個性化的組織工程支架，同時不同材料的復(fù)合使用可以打印出性能更加優(yōu)異的理想支架。隨著不同材料復(fù)合使用研究的深入，結(jié)合組織工程技術(shù)，越來越多的組織工程復(fù)合支架被用于軟骨缺損修復(fù)的研究，顯示了其在軟骨缺損修復(fù)方面的巨大潛力。但復(fù)合支架的實(shí)際臨床運(yùn)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)，如支架的即時打印固化成型、制備過程耗時較長、實(shí)際使用時的無菌保存以及固定方式等均需進(jìn)一步研究。另外，目前尚無臨床3D打印技術(shù)應(yīng)用的相關(guān)政策法律及規(guī)章，且有關(guān)倫理、材料安全等問題尚未解決。