蔣方一丁，呂寶乾，唐繼洪，盧 輝，何 杏，蘇 豪

1海南大學(xué)，海南 儋州 571737；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101

植物利用自己的合成代謝能力產(chǎn)生揮發(fā)物，用以保護(hù)自己免受生物和非生物的壓力，并向互惠互利者和競爭對(duì)手提供信息(可能是假信息)(Baldwin，2010)。植物揮發(fā)物介導(dǎo)植物與節(jié)肢動(dòng)物、微生物和其他植物之間的相互作用，并參與非生物脅迫的反應(yīng)。植物揮發(fā)物排放受到許多環(huán)境因素的影響，包括食草動(dòng)物的破壞、微生物的入侵和鄰近植物的暗示，以及光照、溫度、濕度和養(yǎng)分的有效性。

椰心葉甲BrontispalongissimaGestro(鞘翅目Coleoptera：葉甲總科Chrysomeloidea)傳入中國后，在幾年內(nèi)迅速暴發(fā)成災(zāi)，成為危害我國棕櫚科植物最嚴(yán)重的外來入侵害蟲之一(耿秉晉等，1999)，嚴(yán)重影響了棕櫚植物種植業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)(呂寶乾等，2005)。在椰心葉甲對(duì)椰樹葉片揮發(fā)物的EAG和嗅覺行為反應(yīng)中，椰心葉甲對(duì)寄主植物具有顯著或極顯著的趨向性(楊楠等，2008)。宋曉君等(2011)研究表明，椰心葉甲3齡幼蟲危害誘導(dǎo)產(chǎn)生的(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯，對(duì)椰甲截脈姬小蜂AsecodeshispinarumBoucek有引誘作用。本文以未受椰心葉甲危害和機(jī)械損傷的健康植株和被椰心葉甲危害的植株為研究材料,采用自動(dòng)熱脫附儀-氣相色譜儀-質(zhì)譜儀(TD-GC-MS)技術(shù)測定椰樹健康心葉和受害心葉中的揮發(fā)性物質(zhì)，分析椰心葉甲危害后椰子葉片內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)種類及組成的變化，以期通過化學(xué)生態(tài)學(xué)方法理解椰心葉甲-寄主-天敵(或其他害蟲)三級(jí)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試椰樹品種：本地青椰CocosnuciferaL.，為海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)植株。

1.1 主要儀器

管線切割器(Agilent)、硅膠管(內(nèi)徑1.0 mm，外徑1.8 mm，壁厚0.4 mm，德國Carl Roth)、通風(fēng)柜、真空電熱恒溫干燥箱(DHG-9037A，上海精宏)、老化儀(SC-10，Superlab)、自動(dòng)熱脫附儀-氣相色譜儀-質(zhì)譜儀(MARKES TD100-xr/thermo scientific Trace 1300 GC/ISQ 7000MSD)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鋁箔紙和玻璃石英管的處理 將玻璃石英管、鑷子、剪刀浸泡于正戊烷/二氯甲烷1∶1混合液(500 mL)24 h，并將鋁箔紙切割成15 cm×15 cm。

1.2.2 椰子葉片處理 提前48 h分別將20頭3齡椰心葉甲幼蟲放置在實(shí)驗(yàn)組的10株未受椰心葉甲危害和機(jī)械損傷的健康植株上，另選10株未受椰心葉甲危害和機(jī)械損傷的健康植株作為對(duì)照。

1.2.3 硅膠管和空石英樣品管預(yù)處理 用管線切割器將硅膠管切割成1 cm長的硅膠管，然后在乙腈∶甲醇溶液(4∶1，v∶v)中浸泡3 h以上或過夜，在通風(fēng)柜中晾干，于真空電熱恒溫干燥箱中在100 mL·min-1N2流下210 ℃老化3 h，冷卻到室溫后分裝到棕色玻璃瓶中，充氬氣保存?zhèn)溆谩?/p>

將空石英樣品管置于老化儀中，在60 mL·min-1N2流下335 ℃老化30 min備用。

1.2.4 揮發(fā)物的吸附 用鋁箔紙擦拭去掉葉片表面雜質(zhì)，各取2根老化的1 cm長硅膠管置于干凈玻璃石英管中，用鋁箔紙和封口膜將干凈玻璃石英管密封，置于植株受害處和健康植株心葉處，靜置24 h后，將硅膠管取出，置于老化的空石英樣品管中，用普通冰袋冷凍打包后，進(jìn)行TD-GC-MS分析

1.2.5 揮發(fā)物物質(zhì)的鑒定與比較 產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物通過硅膠管吸附，進(jìn)行TD-GC-MS分析。

色譜條件：石英毛細(xì)管柱 TG-5SILMS(5%苯甲基硅氧烷：0.25 mm×30 m，0.25 μm)；載氣為氦氣，柱流量為 1.0 mL·min-1；熱脫附條件：傳輸線溫度205 ℃；預(yù)解析1 min；一級(jí)解析200 ℃，8 min；二級(jí)解析預(yù)吹掃1 min，低溫-10 ℃，高溫230 ℃，5 min。色譜柱初始溫度30 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升溫速率升至210 ℃；不分流。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度300 ℃；質(zhì)譜范圍20～450 u。通過NIST17數(shù)據(jù)庫比較鑒定椰子葉片產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物。在Excel 2010軟件中進(jìn)行后期編輯，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包含保留時(shí)間、揮發(fā)物、化學(xué)式和CAS號(hào)等信息。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)植株上被椰心葉甲危害之前的葉片以及危害后的葉片進(jìn)行TD-GC-MS檢測分析，共檢測出112種物質(zhì)，其中健康對(duì)照組檢測出80種物質(zhì)，危害后的實(shí)驗(yàn)組檢測出46種物質(zhì)，主要為烴類化合物及其衍生物，相對(duì)含量最高的是環(huán)烴和無環(huán)烴。其中,Heptadecane,2,6,10,14-tetramethyl-在受危害后的葉片中的含量顯著低于危害前含量。-Propyl-1-pentanol、2-Piperidinone, N-[4-bromo-n-butyl]-、Hexadecane, 1,1-bis(dodecyloxy)-、Octadecanal, 2-bromo-、Acetic acid、2-Dodecen-1-yl(-)succinic anhydride、Styrene、Tridecane、1-Iodo-2-methylundecane、Heptadecane, 2,6-dimethyl-等在健康植株中檢出，但被危害后未檢出。而2-Propanol, 1-amino-,(S)-、Germacrene D、1,2,4-Metheno-1H-indene, octahydro-1,7a-dimethyl-5-(1-methylethyl)-,[1S-(1a,2a,3aβ,4a,5a,7aβ,8S*)]-、(1R,9R,E)-4,11,11-Trimethyl-8-methylenebicyclo[7.2.0]undec-4-ene、1-Isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,3,5,6,8a-hexahydronaphthalene、Copaene、Tetradecane、Caryophyllene、Muurolene、Heptadecane, 2,6-dimethyl-等在健康植株中未檢測到，但危害后新檢出(表1)。

3 討論

植物在遭受植食性昆蟲取食后釋放出與健康植株明顯不同的揮發(fā)物，其中與昆蟲形成關(guān)聯(lián)反應(yīng)的揮發(fā)物主要包括烴類化合物、芳香族化合物等(蔡曉明等，2008; 婁永根和程家安，2000)。此次實(shí)驗(yàn)較前人的研究，檢測出更多的化合物，1,2,4-Metheno-1H-indene,octahydro-1,7a-dimethyl-5-(1-methylethyl)-,[1S-(1a,2a,3aβ,4a,5a,7aβ,8S*)]-、Copaene、Muurolene、Heptadecane, 2,6,10,14-tetramethyl--為其中較有代表性的物質(zhì)。

植食性昆蟲取食寄主植物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的揮發(fā)物在寄生蜂的寄主定位過程中起著重要作用(Dickeetal.，1998)，在本實(shí)驗(yàn)中顯著性降低的Heptadecane, 2,6,10,14-tetramethyl-(46.38%→0.29%)已經(jīng)證實(shí)對(duì)天敵蜂類雌蜂具有顯著的吸引作用(呂燕青等，2010)，其含量的降低可能導(dǎo)致對(duì)椰心葉甲天敵的吸引力減弱。

一種物種取食寄主植物后，可以通過改變寄主化學(xué)成分來促進(jìn)另一種物種的暴發(fā)危害(Arianneetal.，2012；Veronicaetal.，2005)。椰心葉甲、椰子織蛾同屬棕櫚科食葉性害蟲，據(jù)野外觀察發(fā)現(xiàn)，部分受危害棕櫚科植物上同時(shí)存在椰心葉甲與椰子織蛾，且兩者之間無明顯競爭作用。在受椰心葉甲危害后，椰子葉片揮發(fā)物中，顯著性增高的1,2,4-Metheno-1H-indene,octahydro-1,、7a-dimethyl-5-(1-methylethyl)-、[1S-(1a,2a,3aβ,4a,5a,7aβ,8S*)]-(0%→11.07%)、Copaene(0%→5.14%)、Caryophyllene(0%→0.19%)、Muurolene(0%→0.30%)已經(jīng)證實(shí)具有對(duì)蛾類產(chǎn)卵極顯著的引誘作用(蔣興川等，2018；馬艷粉等，2012；Butteryetal.，1982；Shelly，2001)，這一結(jié)果說明椰子心葉受椰心葉甲危害后可能會(huì)產(chǎn)生發(fā)揮物以吸引椰子織蛾，造成害蟲的互利入侵，但對(duì)椰子織蛾是否存在其他生理促進(jìn)作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。