石秀芹 許丹妮 張佳嬋 王昌濤，2 安 全 李 萌*

（1北京工商大學(xué)理學(xué)院/植物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083；2北京工商大學(xué)/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048；3云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南昆明650501）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一種近年來從食藥用價(jià)值到經(jīng)濟(jì)效益均受到廣泛研究的食用菌。食用菌的功效主要有：通過激活T細(xì)胞來提高機(jī)體的免疫力[1]；通過降低血糖、血壓和膽固醇來維護(hù)心腦血管的健康[2]；抑制癌細(xì)胞的生長從而達(dá)到抗腫瘤的作用[3]。食用菌中的活性成分如多糖、超氧化物歧化酶等可有效清除自由基來延緩機(jī)體衰老、抗輻射等[4]。

真菌多糖是食用菌活性成分中最為重要的物質(zhì)，真菌多糖具有：抗腫瘤，抗輻射，提高免疫力[5-9]，抗突變[10]，降血壓、血脂、血糖[11-12]，抗氧化，延緩衰老[13-14]等多種功效。研究表明雙孢蘑菇多糖在體外具有良好的抗氧化活性[15]。雙孢蘑菇多糖的提取方法一般有水提法[16]、堿提法、酶輔助提取法[16]223、微波輔助提取法[17]、超聲波輔助提取法[18]、雙水相提取法等[19-21]。

多種真菌多糖在體外和體內(nèi)均證明有良好的自由基清除率以及抗氧化活性[22-23]。目前，已經(jīng)有多種天然活性提取物應(yīng)用于化妝品中[24-25]。多項(xiàng)研究都可表明雙孢蘑菇多糖在體內(nèi)外具有良好的抗氧化功效，因此雙孢蘑菇多糖可作為抗衰老化妝品的天然添加劑應(yīng)用于化妝品中[26-27]。

鄒偉等利用水浴振蕩輔助酶法對雙孢蘑菇多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化[28]，劉丹赤等人探討了微波輔助提取雙孢蘑菇多糖的條件[17]61，高振鵬等研究了超聲波輔助對雙孢蘑菇多糖提取率的影響[20]，吳疆等則應(yīng)用新技術(shù)雙水相提取法提取了雙孢蘑菇多糖[19]5。在優(yōu)化雙孢蘑菇多糖提取工藝的研究中，人們大多采用單因素法或正交法。然而，影響多糖提取率因素相當(dāng)復(fù)雜，而且因素間通常又存在交互作用，因此通過單因素試驗(yàn)往往無法達(dá)到預(yù)期的效果。正交試驗(yàn)可同時(shí)考慮多個(gè)因素，以尋找最佳的因素水平組合。正交試驗(yàn)較單因素試驗(yàn)法更具優(yōu)越性，試驗(yàn)次數(shù)明顯少于同因素同水平的單因素試驗(yàn)。然而正交試驗(yàn)只能給出最佳因素水平組合，無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面法是通過設(shè)計(jì)合理的有限次數(shù)試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，克服傳統(tǒng)正交法的缺陷。筆者研究響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化熱水浸提雙孢蘑菇粗多糖的最佳工藝，找出能夠?qū)㈦p孢蘑菇多糖充分提取出來的最佳條件；并對雙孢蘑菇多糖提取液進(jìn)行濃縮、醇沉、凍干，得到粗多糖，采用凝膠高效液相色譜檢測分子量，最后測定雙孢蘑菇多糖在抗氧化、抗衰老等方面的功效。此研究為雙孢蘑菇多糖能夠作為一純天然提取物應(yīng)用到化妝品、保健品等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇（干）：福建古田產(chǎn)；苯酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（AR）：北京化工廠；葡萄糖標(biāo)品：中國計(jì)量科學(xué)研究院；無水乙醇（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸：安吉耐化學(xué)；FeSO4：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2O2：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HCl：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris：北京華威銳科化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZN-04B小型粉碎機(jī)：北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（40目）：浙江上虞市公路儀器廠；UVmini-1240分光光度計(jì)：日本島津公司；低速大容量離心機(jī)：無錫市瑞江分析儀器有限公司；恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；SHZ-CD型循環(huán)水真空泵：上海貝倫儀器設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)：Bencbtop K Virtis；凝膠色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司（Waters）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液的制備

將干雙孢蘑菇粉碎過40目篩，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料（g）液（mL）比、浸提溫度（℃）、浸提時(shí)間（h），在水浴搖床內(nèi)，以120 r/min進(jìn)行熱水浸提，然后冷卻至室溫，在4500 r/min條件下離心20 min收集上清液。

1.3.2 多糖含量測定

采用苯酚硫酸法測定多糖含量，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定多糖含量：取2 mL待測樣品放入試管中，以2.0 mL去離子水做空白對照，加1.0 mL5%苯酚溶液混勻，再入加入5.0 mL濃硫酸混勻，5 min后封管沸水浴1 h；取出后冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL），并計(jì)算多糖提取率。

1.3.3 多糖提取單因素試驗(yàn)

稱取10.000 g、40目的雙孢蘑菇粉于250 mL錐形瓶中，加入去離子水，選擇不同的料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行提取，離心得到上清液，取樣測定吸光值，計(jì)算雙孢蘑菇多糖提取率。

1.3.3.1 料液比單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5份雙孢蘑菇粉，按照料（g）液（mL）比）為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入去離子水，60℃提取2 h。

1.3.3.2 溫度單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5份雙孢蘑菇粉，料液比為1∶40，分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取2 h。

1.3.3.3 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5份雙孢蘑菇粉，料液比為1∶40，在60 ℃下分別提取1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，遵循Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原則，以料液比、提取時(shí)間和提取溫度三個(gè)因子為自變量，以雙孢蘑菇多糖的提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。表1為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.5 雙孢蘑菇多糖分離與分子量測定

1.3.5.1 雙孢蘑菇多糖干品制備

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將雙孢蘑菇多糖旋蒸至適量（以減少無水乙醇的使用量），向濃縮液中加入3倍體積無水乙醇并低溫沉淀，4℃過夜后可見棕色絮狀粗多糖析出，再4500 r/min離心20 min，收集沉淀物后冷凍干燥，可得多糖粗品。

1.3.5.2 雙孢蘑菇多糖分子量測定

測定條件：利用Waters 2414示差折光檢測器與DAWN HELEOS十八角度激光光散射儀，KS-805與KS-803色譜柱串聯(lián)；設(shè)定RID溫度為50℃，流動相為 0.1 mol/L NaNO3（含 0.02%NaN3），進(jìn) 樣 量 為50 μL，流速為0.8 mL/min。

1.3.6 雙孢蘑菇多糖抗衰老研究

1.3.6.1 對DPPH自由基清除試驗(yàn)

取3 mL待測液與3 mL DPPH溶液混勻，在517 nm下測吸光度（A1）；取3 mL去離子水與3 mL DPPH溶液混勻，測517 nm吸光度（A2）；取3 mL去離子水與3 mL待測液混勻，測517 nm吸光度（A3）；計(jì)算清除率。

1.3.6.2 對羥自由基（·OH）的清除作用試驗(yàn)

在25 mL試管中加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水楊酸，最后加入3 mL1 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，置于37℃水浴中加熱15 min，測510 nm處吸光度（A0）。再加入 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 待測液和 0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0 mL的蒸餾水共1 mL，加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水楊酸，最后加入3 mL 1 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，置于37℃水浴中加熱15 min，測510 nm處吸光度（Ax）。考慮到1.0 mL待測液和水對體系吸光度的降低，分別加入3 mL 2 mmol/L FeSO4和6 mmol/L水楊酸，然后加入3 mL 1 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，置于37℃恒溫15 min后測其吸光度（A00），最后加入1 mL蒸餾水后測一次吸光度（Axx），則有A降低=A00-Axx。

1.3.6.3 對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除作用試驗(yàn)

（1）鄰苯三酚自氧化速率測定

取50 mM pH為8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL、去離子水4.2 mL于25 mL的試管中，充分混勻，置于37℃恒溫水浴中20 min，然后立即加入在37℃恒溫水浴中預(yù)熱過的3 mM鄰苯三酚溶液0.5 mL，充分混勻后倒入比色皿中，每隔30 s在325 nm處測定吸光度，隨后計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘內(nèi)吸光度的增加，以10 mM HCl溶液作為對照，記錄結(jié)果。

（2）加入樣品液后鄰苯三酚自氧化速率測定

按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 的待測樣品，分別加入去離子水4.1 mL、4.0 mL、3.9 mL、3.8 mL、3.7 mL，同樣以10 mM HCl為空白管作為對照。測定325 nm處的吸光度，每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行，取其平均值。

其中：ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速度，ΔA2/Δt為加入樣品后鄰苯三酚自氧化時(shí)反應(yīng)速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響如圖1所示。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

從圖1可以看出，雙孢蘑菇多糖提取率隨料液比的增大而上升，但是在料液比為1∶40以后逐漸趨于平緩。當(dāng)料液比較小時(shí)多糖并未完全溶解，導(dǎo)致提取率較低；料液比過大時(shí)多糖已全部溶解達(dá)到飽和，提取率就會趨于平穩(wěn)。因此確定最佳提取料液比為1∶40。

2.1.2 溫度對多糖提取率的影響

溫度對多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 溫度對多糖提取率的影響

由圖2可以看出，多糖提取率在溫度為50～90℃時(shí)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其原因是隨著溫度的升高，多糖溶解率上升，有利于多糖的溶出，但溫度過高時(shí)會降低一部分多糖的活性，因此提取率又會逐漸下降。高溫伴隨高能耗，會增加提取成本，因此綜合考慮，選擇70℃為最佳提取溫度。

2.1.3 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

提取時(shí)間對多糖提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

由圖3看出，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率逐漸上升，超過3 h以后多糖提取率又逐漸下降并趨于平穩(wěn)。表明多糖提取率與時(shí)間有著密切的關(guān)系，時(shí)間過短則多糖溶解不充分，但時(shí)間過長提取率反而下降，可能因?yàn)闀r(shí)間過長使得多糖受到破壞。因此確定最適提取時(shí)間為3 h。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化雙孢蘑菇多糖提取率

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)軟件Expert Software設(shè)計(jì)出的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到雙孢蘑菇提取率對料液比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

用方差分析對對式進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。模型當(dāng)中的P值用來檢驗(yàn)各因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn)。R2稱為多元相關(guān)的相關(guān)指數(shù)，表示多項(xiàng)式模型方程擬合的可靠性，R2Adj是對回歸方程式中變量過多的一種調(diào)整，表中R2=0.9041，R2Adj=0.7807，兩者相差不大并且接近于1，表示回歸方程效果較好，試驗(yàn)操作可信。由表3可知，該模型P=0.0078，小于0.01，表明二次方程擬合顯著極高；失擬項(xiàng)P大于0.05，表明失擬項(xiàng)對于絕對誤差不顯著；經(jīng)方差分析得到A（料液比），B（溫度），C（時(shí)間），A2對多糖提取率的影響顯著，A、C交互作用顯著，C2極顯著，其余項(xiàng)不顯著，說明各因素對雙孢蘑菇多糖提取率的影響非常復(fù)雜。由P大小可判斷各因素按影響大小排序依次為：料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。

表3 線性回歸模型的方差分析

2.2.2 對響應(yīng)面模型的分析

響應(yīng)面圖可以比較直觀地反映各因素之間的影響，通過多元回歸方程所作的響應(yīng)面如圖4，圖5和圖6所示。根據(jù)模型可對任何兩因素交互影響提取率的效應(yīng)進(jìn)行分析與評價(jià)，并從中確定最佳因素水平范圍。由圖4、5、6可知，提取率的等高線呈橢圓形，說明料液比、溫度、時(shí)間之間相互作用顯著；在一定范圍內(nèi)，提取率均隨著A、B、C的增加呈先上升后趨于平緩的趨勢，說明提取率與A、B、C因素呈現(xiàn)正相關(guān)。

根據(jù)軟件建立的數(shù)學(xué)模型，可以得出用熱水浸提雙孢蘑菇多糖的最佳工藝條件是料液比為1∶50，提取時(shí)間為2.6 h，提取溫度為79.79℃，在這個(gè)條件下雙孢蘑菇多糖提取率為2.36%。按優(yōu)化條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，實(shí)際測得值為2.25%（P＜0.05），與理論值很接近，說明方法可行。

圖4 料液比和提取時(shí)間交互影響多糖提取率響應(yīng)面圖

圖5 提取溫度和提取時(shí)間交互影響多糖提取率的響應(yīng)面圖

圖6 料液比和提取溫度交互影響多糖提取率的響應(yīng)面圖

2.3 雙孢蘑菇多糖分子量測定結(jié)果

熱水浸提的雙孢蘑菇多糖提取液經(jīng)醇沉、凍干后得到易溶于溫水的棕色粉末。經(jīng)凝膠色譜檢測，熱水浸提法提取的雙孢蘑菇多糖相對分子量（Mw）為1.697×106Da。如圖7所示。

圖7 雙孢蘑菇多糖相對分子量

2.4 雙孢蘑菇多糖對DPPH自由基的清除率

將2 mg/mL的雙孢蘑菇多糖分別稀釋10倍、50倍、100倍、150倍，200倍、250倍，測得的自由基清除率如圖8所示。

圖8 雙孢蘑菇多糖對DPPH自由基的清除率

由圖8可以看出，雙孢蘑菇多糖對DPPH自由基的清除作用明顯。隨著稀釋倍數(shù)的增加，雙孢蘑菇多糖對DPPH自由基的清除率下降，說明該多糖與DPPH的清除率存在好的量效關(guān)系。當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL時(shí)對DPPH自由基的清除率高達(dá)70%。

2.5 雙孢蘑菇多糖對羥自由基的清除率

當(dāng)多糖濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2 mg/mL時(shí)對羥自由基清除率如圖9所示。

圖9 雙孢蘑菇多糖對羥自由基的清除率

由圖9可以看出，隨著多糖濃度的升高對羥自由基的清除率有所上升，當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL時(shí)羥自由基清除率仍有上升趨勢。由此也可以得出雙孢蘑菇多糖對羥自由基有清除效果。

2.6 雙孢蘑菇多糖對超氧陰離子自由基的清除率

雙孢蘑菇多糖對超氧陰離子自由基的清除效果見圖10。

圖10 雙孢蘑菇多糖對超氧陰離子自由基的清除率

由圖10可以看出，雙孢蘑菇多糖對超氧陰離子自由基的清除效果并不理想。隨著多糖濃度的升高，對超氧陰離子的清除率只從0.25%上升到0.45%。是否是測量造成誤差或者雙孢蘑菇多糖對超氧陰離子自由基沒有清除效果，還有待研究。

3 小結(jié)

經(jīng)過單因素法和響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提雙孢蘑菇多糖的最佳條件是料液比為1∶50，提取溫度為79.79℃，提取時(shí)間為2.6 h，在這個(gè)條件下，多糖得率為2.25%。雙孢蘑菇多糖水提液低溫醇沉后得到易溶于溫水的棕色粉末，該粉末為雙孢蘑菇多糖干品，經(jīng)測定得出相對分子量為1.697×106Da。雙孢蘑菇多糖對三種自由基的清除效果中，以對DPPH自由基的清除效果最好。

對雙孢蘑菇多糖的提取工藝優(yōu)化及對多糖結(jié)構(gòu)初步鑒定，為后續(xù)研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)鑒定一直是多糖研究中的難題。進(jìn)一步純化雙孢蘑菇多糖，得到明確的雙孢蘑菇多糖結(jié)構(gòu)也是后續(xù)的研究方向之一，同時(shí)這也是建立雙孢蘑菇多糖的構(gòu)效關(guān)系的必要前提。雙孢蘑菇多糖的體外清除自由基試驗(yàn)結(jié)果表明其具有良好的抗氧化活性，可進(jìn)一步從生化試驗(yàn)、人體及細(xì)胞多角度綜合判斷來建立雙孢蘑菇多糖抗衰老活性與結(jié)構(gòu)和量之間的關(guān)系。