蘇建淳，張國義，盧秋霞，全 強

廣東省佛山市第一人民醫(yī)院鼻咽放療二科(佛山528000)

最新發(fā)布的2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，鼻咽癌占所有惡性腫瘤的0.7%,以性別分層,男性中鼻咽癌新發(fā)病例占新發(fā)癌癥的2.2%[1]。盡管放療、化療等治療技術不斷進步，鼻咽癌取得了不錯的療效，但鼻咽癌易轉(zhuǎn)移、復發(fā),仍有19%～56% 的患者在放療后 5 年內(nèi)復發(fā),尤其是晚期鼻咽癌患者[2-3]。目前對鼻咽癌復發(fā)及轉(zhuǎn)移仍缺乏有效低毒的治療手段，研究其進展及轉(zhuǎn)移的分子機制，探索新的治療模式，成為近年來研究的重點之一[4]。微小RNA(microRNA,miRNA) 是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA的3’Um端結(jié)合進而降解mRNA或抑制翻譯過程。已有多種miRNA被發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中存在異常性表達[5]。miR-124已被證實在多種腫瘤中發(fā)揮作用，也有研究顯示其能抑制鼻咽癌細胞的增殖，但在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移及預后方面相關報道不多。為進一步探討miR-124在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義，本研究應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測62例鼻咽癌組織miR-124表達情況，探討其表達強度與遠處轉(zhuǎn)移和預后的關系。

資料與方法

1 一般資料 收集 2014年1月至2015年9月在我院診治的鼻咽癌患者62例，其中53例無遠處轉(zhuǎn)移，9例伴遠處轉(zhuǎn)移;男性45例，女性17例，平均年齡(47.58±12.45)歲。病例納入標準：治療前進行活檢確診為鼻咽癌，確診后均予放化療治療，未患其他癌癥或嚴重的心、肝、腎、腦等病變，非孕婦，相互無血緣關系,均為漢族。為確定局部復發(fā)情況及遠處轉(zhuǎn)移范圍，所有患者均常規(guī)行MRI等相關檢查。排除標準：患者存在有放化療相關禁忌證；既往患有其他腫瘤病史；接受過任何免疫治療、分子治療等抗腫瘤治療。選取同期62例慢性鼻咽炎患者為對照組，按照性別、年齡進行匹配。所有標本均為治療前活檢標本，儲存于-80℃待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

2 隨 訪 對62例患者進行隨訪，了解遠處轉(zhuǎn)移時間、死亡時間及原因。發(fā)現(xiàn)死亡或轉(zhuǎn)移隨訪即終結(jié)。隨訪時間從第一次明確診斷開始，到發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移時間或死亡時間或末次隨訪時間，截止到2018年9月30日。無瘤生存期(DFS) 時間從初次治療開始至發(fā)生轉(zhuǎn)移或死亡時為止。

3 材料與主要試劑 人鼻咽癌細胞株CNE-1(美國 ATCC 公司)，GAPDH 抗體(美國 Abcam公司)，IgG二抗(上海碧云天公司)，miR-124 siRNA、NC siRNA(蘇州吉瑪制藥公司)，Lipofectamine-2000、RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Invitrogen公司)；RNA 提取試劑 Trizol (美國 Life 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量實時聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(TaKaRa 公司)，miR-124逆轉(zhuǎn)錄引物(廣州銳博公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁化學研究所),Invasion和Migration試劑盒(美國Millipore公司)。

4 RT-qPCR方法 提取組織中總RNA，采用RT-qPCR方法檢測標本中miR-124 的表達水平，以及與分期、轉(zhuǎn)移及預后等臨床資料之間的關系。實驗操作按照試劑盒及文獻方法操作。RT-qPCR 條件：95℃ 1 min；95℃15 s、60℃ 20 s，循環(huán)40次；取U6作為內(nèi)參照。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法對miR-124在癌組織及對照組標本中的表達量進行相對定量分析。

5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CNE-1在10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為 37℃，CO2濃度為5%。將細胞傳代培養(yǎng)至第3代，以70%～80%的密度接種于培養(yǎng)基中。根據(jù)說明書，使用Lipofectamine-2000將miR-124 siRNA轉(zhuǎn)染至CNE-1細胞，進行以下實驗。

6 CCK-8細胞增殖活性測定 將指數(shù)生長的CNE-1細胞(5×105細胞/ml)接種到96孔板，培養(yǎng)72 h，加入CCK-8溶液(10 μl /ml)，37℃、5% CO2條件下孵育4 h。使用酶標儀板在490 nm波長下測量細胞在24、48、72 h的OD值，細胞活力(% ) =[OD(miR-124 siRNA)-OD(空白)]/[OD(NC siRNA)-OD(空白)]×100%。

7 Transwell遷移、侵襲實驗 將200 ml的培養(yǎng)基(1×104個細胞)接種到每個Transwell中，并在37℃下孵育24 h，去除留在腔室上表面的細胞，而膜的下表面用4%多聚甲醛固定 20 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色5 min，洗滌后，使用Image-Pro Plus6.0軟件測定不同組中的細胞數(shù)。侵襲實驗:40 ml Matrigel基質(zhì)膠 4℃下過夜融化，并與3體積的無血清培養(yǎng)基混合均勻后加入24 孔Transwell小室(每孔50 μl)，其余實驗步驟及方法參照實驗說明書。

結(jié) 果

1 臨床病理特征 62例鼻咽癌患者，其中初治時53例無轉(zhuǎn)移、9例初治時已有遠處轉(zhuǎn)移；TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共9例、Ⅲ期14例、Ⅳa期30例、Ⅳb期9例，其中Ⅰ期、Ⅱ期為早期，Ⅲ期為中期，Ⅳa期為局部晚期，Ⅳb期為晚期。隨訪結(jié)果顯示3例失訪，59例隨訪患者隨訪時間4～57個月，出現(xiàn)死亡或轉(zhuǎn)移隨訪即終結(jié)；其中死亡5例，轉(zhuǎn)移7例，47例無瘤生存。DFS≥3年的41例，DFS<3年的18例。

2 鼻咽癌組織中miR-124的表達水平 RT-qPCR結(jié)果顯示，鼻咽癌組組織中miR-124的表達量為(1.49±0.39)，對照組組織中miR-124的表達量為(2.12±0.43)。統(tǒng)計分析提示，鼻咽癌組織中miR-124的表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.545，P<0.01)。見圖1。

與對照組比較，*P<0.01

3 miR-124的表達與鼻咽癌臨床病理特征之間的關系 分析miR-124表達量與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系結(jié)果顯示，miR-124的表達強度與性別、年齡無關(P>0.05) ，初治時轉(zhuǎn)移組miR-124表達量顯著低于無轉(zhuǎn)移組(P<0.05) ；TNM分期中，Ⅲ-Ⅳ期晚期患者癌組織中miR-124 的表達顯著低于Ⅰ-Ⅱ期早期患者。見表 1。

表1miR-124的表達與62例鼻咽癌患者臨床病理特征之間的關系

4 miR-124的表達與鼻咽癌患者預后的關系 以有效隨訪的鼻咽癌患者無瘤生存期(DFS) 時間作為預后情況指標。有效隨訪的59例中，DFS≥3年41例，DFS<3年18例。DFS≥3年組miR-124表達量(1.83±0.49)明顯高于DFS<3年組miR-124的表達量(1.18±0.34)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.103,P<0.01)。見圖2。

與DFS<3年組比較，*P<0.01

5 miR-124過表達對人鼻咽癌CNE-1細胞系增殖、遷移、侵襲的影響 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA顯著提高miR-124在人鼻咽癌CNE-1細胞中的表達水平(圖 3A)。CCK8實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA與轉(zhuǎn)染NC-siRNA相比，在24、48、72 h 這三個時間點，CNE-1細胞增殖數(shù)目明顯減少，說明miR-124 siRNA能夠顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖(圖3B)。Transwell 實驗表明CNE-1細胞遷移及侵襲數(shù)目明顯低于轉(zhuǎn)染NC-siRNA組(圖3C)，提示轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA能夠顯著抑制鼻咽癌細胞的侵襲及遷移。

圖3 miR-124過表達對人鼻咽癌CNE-1細胞系增殖、遷移、侵襲的影響

討 論

鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個復雜過程，遠處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌死亡的首要原因。但目前鼻咽癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移機制尚未明確，缺乏指示鼻咽癌早期復發(fā)的分子生物學標志物。深入研究鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機制尤其是遠處轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找預測分子標記物，對鼻咽癌的臨床治療有重要意義。殷亞磊等[6]研究發(fā)現(xiàn)LASS2蛋白表達與鼻咽癌復發(fā)負相關，LASS2陰性患者復發(fā)風險更大。張璐等[7]發(fā)現(xiàn)EBV病毒、NLR、VCA-IgA、同步放化療等與鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移密切相關。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-3182可能促進鼻咽癌細胞遠處轉(zhuǎn)移。miRs作為新的致癌或抑癌基因與多種癌癥的發(fā)生密切相關[9]，如前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等。近年來，miR-124被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生、進展相關，包括肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌等多種腫瘤。

本研究中鼻咽癌組織中miR-124的表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示miR-124低表達能夠促進鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，與田允鴻等[10]、許珊等[11]的體外實驗中結(jié)果一致。miR-124在鼻咽癌組織中的表達強度與性別、年齡無關，但與是否轉(zhuǎn)移及臨床分期相關。研究結(jié)果顯示,TNM分期中,Ⅲ-Ⅳ期晚期患者癌組織中miR-124 的表達顯著低于Ⅰ-Ⅱ期早期患者，說明TNM分期越晚，miR-124的表達越低；初治時有遠處轉(zhuǎn)移組的miR-124表達量顯著低于無轉(zhuǎn)移組，提示miR-124的低表達在鼻咽癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。對59例鼻咽癌患者的隨訪發(fā)現(xiàn)，無瘤生存期(DFS)≥3年者miR-124表達量明顯高于DFS<3年者，差異有統(tǒng)計學意義，提示miR-124表達越高，患者預后越好。

本研究通過體外實驗證實，轉(zhuǎn)染miR-124 siRNA可顯著提高miR-124在人鼻咽癌CNE-1細胞表達水平，能夠顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移及侵襲。通過以上結(jié)果，我們推測miR-124抑制鼻咽癌腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，進而抑制鼻咽癌的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移；miR-124可能通過干擾腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因表達抑制鼻咽癌細胞復發(fā)、轉(zhuǎn)移。當然，本研究由于樣本量受限，這一結(jié)果還需要在大樣本研究中進一步驗證。下一步，我們將對miR-124在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的信號通路及調(diào)控的靶基因進行深入研究。

總之，我們研究證實了miR-124在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可預測鼻咽癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移。miR-124抑制鼻咽癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移和對預后影響的作用機制及其在探索新的治療方法中的價值有待進一步研究。今后，我們將對鼻咽癌發(fā)展過程中miR-124的作用機制進行進一步深入研究。