胡亞微, 楊 洋, 彭錦峰

(1. 陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2. 西安交通大學(xué)食品裝備工程與科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710049)

大米是亞洲人口的主要糧食作物之一,隨著生活水平的提高,具有優(yōu)質(zhì)香味的香米更被消費(fèi)者所青睞。香米的主要生產(chǎn)國(guó)是印度、巴基斯坦和泰國(guó),印度和巴基斯坦出口的香米主要是巴斯馬蒂米(basmati rice),而泰國(guó)主要出口茉莉香米(jasmine rice)[1],我國(guó)生產(chǎn)的香米最廣為人知的是五常稻花香米。自1982年Buttery等[2]確定2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,簡(jiǎn)稱2-AP)是香米香味的主要成分以來(lái),無(wú)論是在食品貿(mào)易領(lǐng)域?qū)τ谠摶衔锏木珳?zhǔn)檢測(cè)[3],還是在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域關(guān)于選育和調(diào)控高含量2-AP稻米的研究[4-7],以及在食品加工領(lǐng)域如何使香米的香味成分能夠持久保持[8]或是開(kāi)發(fā)出高穩(wěn)定性的具有米香氣味的食品風(fēng)味成分[9,10],都一直是研究人員所關(guān)注的熱點(diǎn)。2-AP是一種沸點(diǎn)較低的小分子雜環(huán)化合物,其相對(duì)分子質(zhì)量為111.14,作為食品中主要的香味化合物之一,具有烤面包、堅(jiān)果、爆米花的香氣,相關(guān)研究表明它在空氣中具有極低的氣味閾值(0.02 ng/L)[11],即使在香米中含量極低都很容易被人類嗅覺(jué)系統(tǒng)所感知。

天然香米中2-AP的含量通常低至微克每千克,Wakte等[3]報(bào)道的不同種類香米中2-AP含量范圍為0.2～2 746 μg/kg, Wei等[12]報(bào)道的香米精米中2-AP含量范圍與Wakte報(bào)道的類似,他們還特別指出香米糙米中2-AP的含量為100～760 μg/kg。由于該化合物含量的高低直接影響香米香味濃郁程度和價(jià)格[13],因此,在大米進(jìn)出口貿(mào)易過(guò)程中,如何準(zhǔn)確測(cè)定這種特征性香味成分就顯得尤為重要。但在實(shí)際樣品的測(cè)定過(guò)程中,對(duì)大米樣品進(jìn)行必要的蒸餾、萃取等前處理時(shí),通常需要在較高溫度下進(jìn)行,從而導(dǎo)致前處理過(guò)程中可能會(huì)有2-AP的損失或新的2-AP生成[14];在采用氣相色譜等現(xiàn)代分析檢測(cè)儀器進(jìn)行測(cè)定時(shí),分離過(guò)程中共流出物的干擾或是同分異構(gòu)體的影響[15,16]會(huì)使獲取準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果具有相當(dāng)?shù)碾y度。目前,常用的樣品前處理方法主要有減壓蒸餾或水蒸氣蒸餾等蒸餾法(distillation)、同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取法(SFE)、頂空或頂空吸附萃取法(HSSE)、固相微萃取法(SPME)等。常用的檢測(cè)方法主要有氣相色譜(GC)法或氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)試(GC-olfactory, GC-O)法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法等。本文主要介紹香米中特征性香味成分2-AP分析測(cè)定時(shí)的樣品前處理和儀器分析方法研究進(jìn)展,為相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)、快速、高效的2-AP檢測(cè)方法提供參考。

1 樣品前處理方法

1.1 蒸餾法

減壓蒸餾法(又稱真空蒸餾)通過(guò)減少裝置內(nèi)的壓力而降低液體的沸點(diǎn),在較低的溫度下即可收集到樣品餾分,可以有效地避免餾分分解。早在1978年,Withycombe等[17]將2 kg香米和6 L飽和氯化鈉溶液在45 ℃下減壓蒸餾4.5 h,成功地從香米中提取出2-AP。但是減壓蒸餾法通常需要的蒸餾時(shí)間較長(zhǎng),且操作過(guò)程中對(duì)壓力控制要求較高,控制不當(dāng)時(shí)容易導(dǎo)致蒸餾失敗。而水蒸氣蒸餾法是提取植物樣品中香味成分最常見(jiàn)的方法之一。將樣品在水中浸泡后,直接進(jìn)行蒸餾,樣品中的揮發(fā)性成分隨水蒸氣餾分一并帶出,經(jīng)過(guò)冷凝管冷凝后,即可在裝置末端收集到揮發(fā)性成分。1986年,Buttery等[18]利用水蒸氣蒸餾法,將200 g香米和6 L水蒸餾2 h后,用酸化的乙醚萃取收集的餾分,結(jié)合相應(yīng)的儀器分析手段,最終對(duì)4種不同類型香米中的2-AP進(jìn)行定量分析。1988年,Buttery等[19]用類似的方法,對(duì)64種煮熟的香米中的化合物進(jìn)行定量分析,并確定了它們?cè)谒芤褐械臍馕堕撝?其中2-AP的閾值為0.1 μg/L。直到2006年,Nadaf等[20]仍然采用減壓條件下對(duì)200 g香米糙米樣品進(jìn)行水蒸氣蒸餾,再用二氯甲烷對(duì)收集的水蒸氣冷凝物進(jìn)行萃取,并進(jìn)一步濃縮、干燥后進(jìn)行儀器分析測(cè)定,測(cè)得幾種香米中2-AP的含量范圍是0.028～0.061 mg/kg。

1.2 同時(shí)蒸餾萃取法

SDE法是將樣品蒸氣與萃取溶劑的蒸氣在同一個(gè)密閉裝置內(nèi)混合,沸點(diǎn)較低的揮發(fā)性成分首先被蒸餾出來(lái)后,立即被萃取溶劑的蒸氣在冷凝管上萃取。SDE法將水蒸氣蒸餾和溶劑萃取的過(guò)程合二為一,與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比,減少了實(shí)驗(yàn)步驟,降低了樣品在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的損失。Buttery等[21]利用SDE法對(duì)10種不同類型香米中的2-AP進(jìn)行萃取,他們將500 g香米與6 L水混合進(jìn)行蒸餾,同時(shí)用乙醚作萃取溶劑,在高溫下萃取2 h,再進(jìn)入相應(yīng)的儀器完成檢測(cè)。結(jié)果顯示,10種香米中2-AP的含量為0.006～0.09 mg/kg。1991年,Tanchotikul等[22]對(duì)SDE法的裝置進(jìn)行改進(jìn),設(shè)計(jì)了一種新型的微量SDE法,該方法僅需1 g香米和100 mL蒸餾水,就可以實(shí)現(xiàn)香米中2-AP的提取。但是SDE法在提取過(guò)程中一般要求較高的操作溫度,對(duì)于揮發(fā)性較強(qiáng)的香味成分,可能會(huì)造成一定損失。

1.3 溶劑萃取法

溶劑萃取法是利用樣品中各組分在特定溶劑中的溶解性質(zhì)差異,從而達(dá)到分離的效果。Wijit等[23]先用鹽酸溶液對(duì)泰國(guó)水稻種子中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取,再用二氯甲烷反萃取,GC-MS分析,共檢測(cè)出35種揮發(fā)性成分。應(yīng)興華等[24]用體積比為1∶1的無(wú)水乙醇-二氯甲烷為萃取劑,在80 ℃下對(duì)11份香稻育種材料中的2-AP進(jìn)行了萃取,萃取3 h后將萃取液進(jìn)行GC-MS分析,測(cè)得2-AP的含量為0.045～0.699 mg/kg。Hien等[25]則直接用400 mL純乙醇為萃取溶劑,將100 mg經(jīng)研磨的稻米樣品在70 ℃下萃取2 h,高速離心后,上清液直接進(jìn)行GC-MS測(cè)定,測(cè)得36個(gè)香米中2-AP含量為0～430.7 μg/kg。溶劑萃取法步驟簡(jiǎn)單、操作方便,但有時(shí)受基質(zhì)影響嚴(yán)重,容易造成結(jié)果失真。Laohakunjit等[26]用超臨界流體萃取、同時(shí)蒸餾萃取和有機(jī)溶劑萃取3種方法萃取了用于給米飯?jiān)鱿愕南闾m葉中的2-AP,結(jié)果表明,采用乙醇浸泡萃取測(cè)得2-AP的含量為 2 771 μg/kg,這一結(jié)果是采用其他兩種萃取方法獲得結(jié)果的4倍多,研究人員認(rèn)為,這可能與香蘭葉中的色素溶于乙醇有很大關(guān)系,復(fù)雜基質(zhì)干擾造成了測(cè)定結(jié)果偏高。

1.4 超臨界流體萃取法

SFE是目前國(guó)際上較先進(jìn)的物理萃取技術(shù),該方法通過(guò)改變壓力或溫度使超臨界流體密度大幅改變,在超臨界狀態(tài)下,讓超臨界流體與待萃取物質(zhì)接觸,使其選擇性地將不同性質(zhì)的成分萃取出來(lái)。CO2因?yàn)槠浒踩珶o(wú)毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn),是超臨界流體萃取中最常用的萃取劑。Laohakunjit等[26]采用超臨界CO2流體萃取法,在20 MPa、50 ℃條件下,對(duì)用于給大米增香的香蘭葉萃取了20 min。結(jié)果表明,香蘭葉中2-AP的含量為716 μg/kg,而提取時(shí)間更久的SDE,提取的2-AP的含量?jī)H為1.5 μg/kg,測(cè)定結(jié)果明顯偏低主要是由于萃取過(guò)程中加熱導(dǎo)致2-AP的損失。

1.5 頂空法或頂空吸附萃取法

頂空法(頂空直接進(jìn)樣分析法)是將樣品加熱后,直接收集樣品頂空氣體進(jìn)行分析的一種方法。Limpawattana等[27]將100 g大米加入150 mL蒸餾水蒸煮,收集70 ℃時(shí)產(chǎn)生的頂空氣體,再通過(guò)活性炭柱凈化,隨后全部進(jìn)入Tenax捕集器進(jìn)行捕集,捕集器中的氣體在氣相色譜儀進(jìn)樣口熱解吸池中于250 ℃解吸5 min后,先通過(guò)一段3 cm長(zhǎng)的冷阱柱,該冷阱柱由CO2冷卻,溫度設(shè)定為-40 ℃,這樣可以使氣體先冷凝下來(lái),達(dá)到聚集的效果,再快速升溫至200 ℃,進(jìn)入后續(xù)的GC測(cè)定。通過(guò)這種方法,研究人員對(duì)韓國(guó)13種特色大米的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,成功鑒定出了特征性香味成分2-AP。Sriseadka等[15]采用靜態(tài)頂空直接進(jìn)樣結(jié)合GC分析,測(cè)定了大米樣品于120 ℃條件下加熱9 min后頂空氣體中2-AP的含量。HSSE與SPME非常相似,都依賴于樣品、頂部空間和吸附裝置上的涂層三者之間的平衡,但HSSE的吸附容量是SPME的50倍,這也意味著它需要更久的時(shí)間來(lái)達(dá)到平衡。Grimm等[28]采用HSSE、在40 ℃下,對(duì)1 g香米樣品吸附萃取4 h,實(shí)現(xiàn)了香米中2-AP的分離分析。

1.6 固相微萃取法

SPME是基于涂有固定相的熔融石英纖維來(lái)吸附、富集樣品中待測(cè)物質(zhì)的一種樣品前處理方法。該方法集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體,前處理速度快,采用頂空萃取模式時(shí)基質(zhì)干擾相對(duì)較小,是目前常見(jiàn)的食品中揮發(fā)性成分分析前處理方法之一。Laguerre等[29]采用SPME與MS直接分析相結(jié)合的方法,無(wú)需色譜柱對(duì)萃取物質(zhì)進(jìn)行分離,通過(guò)多變量分析,構(gòu)建了質(zhì)量傳感器,用于快速區(qū)分香米和非香米。Lee等[30]則利用頂空固相微萃取(HS-SPME)對(duì)無(wú)菌包裝即食香米飯中的2-AP進(jìn)行了萃取,發(fā)現(xiàn)2-AP的加標(biāo)回收率低于10% ,其主要原因是樣品基質(zhì)的影響,為解決這一問(wèn)題,作者采用標(biāo)準(zhǔn)加入法制作校正曲線,實(shí)現(xiàn)了即食米飯中2-AP的精確測(cè)定,并建議采用同位素內(nèi)標(biāo)法以簡(jiǎn)化校正曲線制作過(guò)程。

在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,SPME方法的萃取效果除受到樣品基質(zhì)影響外,還可能受到纖維涂層類型、萃取溫度、萃取時(shí)間等多方面因素的影響[31]。常用的商品化SPME纖維涂層材料主要有聚苯胺(PA)、碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)、碳分子篩/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(CAR/DVB/PDMS)等。早在2001年,Grimm等[32]采用SPME對(duì)米粒中的2-AP進(jìn)行了萃取分析。研究人員通過(guò)優(yōu)化萃取時(shí)間、萃取溫度及樣品加水量3個(gè)因素,最終選擇在0.75 g米粒中加入100 μL水,80 ℃條件下,穩(wěn)定25 min,使用CAR/DVB/PDMS纖維萃取15 min而獲得最佳萃取效果。Akhoundzadeh等[33]比較了4種常用的固相微萃取纖維在頂空萃取模式下對(duì)香味成分的萃取效果,發(fā)現(xiàn)CAR/DVB/PDMS纖維相對(duì)于PA、CAR/PDMS和DVB/PDMS纖維而言,具有更高的萃取容量。Xie等[34]選擇CAR/DVB/PDMS纖維,通過(guò)條件優(yōu)化,結(jié)合后續(xù)的儀器分析方法,對(duì)單粒香米中的2-AP含量進(jìn)行了測(cè)定。該方法的LOD和LOQ分別是1.0 μg/kg 和4.0 μg/kg。Dias等[35]選擇同樣的纖維對(duì)2.5 g研磨過(guò)的香米中包括2-AP在內(nèi)的多種揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取,結(jié)合GC-MS測(cè)定和主成分分析結(jié)果,實(shí)現(xiàn)不同類別香米的區(qū)分。

Ghiasvand等[36]在對(duì)不同香稻中揮發(fā)性成分分析時(shí),對(duì)固相微萃取裝置進(jìn)行了改進(jìn)。他們認(rèn)為,高溫雖然可以加快待測(cè)物的分子擴(kuò)散速度,有利于縮短達(dá)到平衡所需的時(shí)間,但同時(shí)也會(huì)降低纖維和待測(cè)物之間的分配系數(shù),從而降低纖維涂層對(duì)待測(cè)物的吸附量。因此,他們?cè)谳腿〉耐瑫r(shí),通入二氧化碳冷卻纖維,提高纖維和待測(cè)物之間的分配系數(shù),最終提高了纖維的吸附容量。Hopfer等[14]在對(duì)單粒香米中的2-AP進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn),CAR/DVB/PDMS纖維萃取效果雖然比DVB/PDMS纖維好,但解吸附后會(huì)有少量殘留,對(duì)痕量測(cè)定有一定的影響。因此他們選擇DVB/PDMS纖維進(jìn)行方法優(yōu)化,所建立方法的線性范圍為53～5 380 ng/kg。但是SPME受纖維涂層種類的限制,而目前商品化的涂層有限,且一些涂層在高溫下穩(wěn)定性不好,因此導(dǎo)致結(jié)果的重現(xiàn)性難以令人滿意[31]。此外,相關(guān)研究還表明,采用SPME方法萃取樣品中的2-AP,萃取到纖維上的總量只占到樣品中2-AP總量的0.3%[32],這對(duì)于在樣品中實(shí)際含量只有微克每千克水平的2-AP來(lái)說(shuō),想要獲得精確測(cè)定結(jié)果,對(duì)測(cè)定儀器的靈敏度和穩(wěn)定性要求都很高。根據(jù)Ouyang等[37]的報(bào)道,隨著近年來(lái)新型SPME涂層研制速度的加快、預(yù)平衡萃取理論及自動(dòng)化SPME裝置的應(yīng)用,以及通過(guò)研磨、鹽析、調(diào)節(jié)樣品酸度等多種途徑改善樣品基質(zhì)的影響,SPME在食品中風(fēng)味成分的分析方面,穩(wěn)定性和精確性已經(jīng)得到顯著提高。胡翠英等[38]制備了一種Nafion和聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDAC)復(fù)合SPME新涂層,測(cè)定2-AP時(shí)LOD可達(dá)0.10 ng/mL。孫謙等[39]利用自動(dòng)化SPME裝置與GC-MS聯(lián)用,通過(guò)測(cè)定香米中2-AP含量可快速鑒別香米真?zhèn)?方法的重現(xiàn)性較好。

綜上可知,對(duì)于香米特征性香味成分2-AP分析測(cè)定的樣品前處理方法,傳統(tǒng)的需要使用多達(dá)幾千克樣品并且耗費(fèi)大量時(shí)間和有機(jī)試劑的蒸餾法、溶劑萃取法等方法將逐漸被綠色環(huán)保、消耗樣品及試劑更少的超臨界流體法、頂空法或固相微萃取法所取代。特別是自動(dòng)化固相微萃取技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展成熟以及與儀器在線聯(lián)用的便利性、新型性能更加穩(wěn)定的固相微萃取纖維的研制等,將使得固相微萃取技術(shù)成為對(duì)樣品中2-AP進(jìn)行高效萃取分離的有效手段之一。

2 檢測(cè)方法

2.1 氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法

GC常用于分析低沸點(diǎn)、小分子、弱極性化合物。由于2-AP的物理化學(xué)性質(zhì)特別適合采用GC分析檢測(cè),自該物質(zhì)被鑒定為香米的特征性香味成分以來(lái),大多數(shù)的測(cè)定都是基于GC分離再結(jié)合FID、NPD、MS等檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)而完成的。在分離柱的選擇上,盡管大多數(shù)情況下通用型的色譜柱即可實(shí)現(xiàn)樣品中2-AP組分的分離,但考慮到2-AP本身的極性特點(diǎn),采用WAX柱等極性較強(qiáng)的色譜柱對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品中2-AP的分離效果較非極性柱要好一些。Hien等[25]采用60 m長(zhǎng)的WAX毛細(xì)管柱,實(shí)現(xiàn)了大米乙醇提取液中2-AP的高效分離。Sriseadka等[15]采用GC分離,研究了火焰離子化檢測(cè)器(FID)和氮磷檢測(cè)器(NPD)對(duì)2-AP的響應(yīng)情況。結(jié)果表明,使用FID時(shí),2-AP的LOD為20 ng;而使用NPD,其LOD可達(dá)5 ng。NPD相對(duì)于FID雖然可獲得更高的靈敏度,但采用NPD時(shí),對(duì)于頂空直接進(jìn)樣分析,要求樣品中的水分含量不能高于14%[40]。

由于MS具有靈敏度高、定性能力強(qiáng)等特點(diǎn),因此常用于大米中2-AP的測(cè)定。Akhoundzadeh等[33]將HS-SPME和GC-MS聯(lián)用,通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)香米中的香味成分進(jìn)行鑒定,從伊朗南部的一種香米中鑒定出了包括2-AP在內(nèi)的123個(gè)成分。Mahmud等[41]則采用HS-SPME結(jié)合GC-MS方法,研究了研磨過(guò)程對(duì)于包括2-AP在內(nèi)的多種香味成分測(cè)定的影響。由于采用GC分離時(shí),樣品基質(zhì)中與2-AP性質(zhì)相似的化合物可能會(huì)與2-AP共流出;此外,2-AP的同分異構(gòu)體也無(wú)法通過(guò)GC進(jìn)行有效分離,這兩種情況都對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)果的獲取造成很大影響。研究人員除采用常規(guī)的GC-FID/NPD或GC-MS方法外,還采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(GC-TOF-MS)、全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(GC×GC-TOF-MS),或是氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)對(duì)樣品中的2-AP進(jìn)行測(cè)定。Ghiasvand等[36]采用冷纖維SPME結(jié)合GC-TOF-MS測(cè)定了伊朗香米中2-AP的含量,能夠準(zhǔn)確快捷地識(shí)別出樣品中的2-AP; Sansenya等[42]則用HS-SPME結(jié)合GC-MS/MS的方法,研究了泰國(guó)本土香米中2-AP的含量、生物相關(guān)化合物等與香味程度之間的相關(guān)性。Hopfer等[14]利用HS-SPME-GC-MS/MS方法實(shí)現(xiàn)了單粒米中2-AP的精確定量。Daygon等[16]則采用GC×GC-TOF-MS方法從代謝組學(xué)和基因組學(xué)角度揭示了香米呈現(xiàn)香味的機(jī)理,并鑒定出和2-AP具有相似香味的同分異構(gòu)體6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四羥基吡啶(6M5OTP)。

2.2 氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)定法

GC-O是將嗅覺(jué)分辨和儀器檢測(cè)結(jié)合起來(lái)的分析技術(shù)。GC將試樣組分分離開(kāi),嗅辨員通過(guò)嗅探口對(duì)聞到的氣味進(jìn)行描述并記錄,進(jìn)而獲得樣品的氣味特征。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠識(shí)別出和基質(zhì)組分共流出的氣味組分,更加直觀地描述氣味特征。Yang等[43]采用動(dòng)態(tài)頂空和GC-O法,對(duì)6種不同類型香米的香味成分進(jìn)行了研究。評(píng)估出25種主要的氣味化合物,并確定了它們?cè)诳諝庵械臍馕堕撝?其中2-AP的閾值最低(0.02 ng/L)。Maraval等[44]通過(guò)GC-O法,將產(chǎn)自法國(guó)的兩種香米與亞洲的一種典型香米進(jìn)行比較,共得到了40種氣味成分化合物,其中2-AP是3種香米中共有的特征性成分。張敏等[45]利用GC-O-MS方法分析了秈米和粳米等不同稻米蒸煮成米飯的不同風(fēng)味,在秈米為原料的米飯中未檢出2-AP。

2.3 電子鼻測(cè)定法

電子鼻(E-nose)又稱氣味掃描儀,主要由氣敏傳感器陣列、信號(hào)預(yù)處理和模式識(shí)別3部分組成。它以特定的傳感器和識(shí)別模式,快速識(shí)別樣品中的氣味。相對(duì)于傳統(tǒng)人工嗅覺(jué)技術(shù),該技術(shù)借助模式識(shí)別等人工智能手段,克服了因嗅辨員的主觀評(píng)判可能導(dǎo)致的重復(fù)性不好的問(wèn)題。Timsorn等[46]通過(guò)電子鼻技術(shù)和主成分分析法,對(duì)香米中摻雜的普通大米含量進(jìn)行評(píng)估,其線性關(guān)系(r2)> 0.94。Serafico等[47]采用類似的方法,對(duì)不同類型的菲律賓香米品種進(jìn)行區(qū)分,準(zhǔn)確度達(dá)到95% 。這些電子鼻測(cè)定法,無(wú)論是對(duì)香米摻雜的分析,還是對(duì)不同類型香米的區(qū)分,其所依據(jù)的主要成分之一便是香米特征性香味成分2-AP。

2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GC分離分析雖然對(duì)沸點(diǎn)低、相對(duì)分子質(zhì)量較小的2-AP有較大的優(yōu)勢(shì),但該分析方法通常需要與高溫蒸餾或高溫萃取等樣品前處理方法相結(jié)合,而由于2-AP本身的熱不穩(wěn)定性且在高溫條件下可由還原糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)而生成的特性[14,48],使得采用GC相關(guān)的分析測(cè)定法會(huì)因前處理過(guò)程中2-AP的損失或是新生成而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。與GC分離分析相比,LC對(duì)待測(cè)物的沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性等要求較低。Jost等[48]采用pH 7.4的磷酸緩沖液為提取試劑,對(duì)香米等食品中的2-AP進(jìn)行超聲提取后,以鄰苯二胺為衍生試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng),生成穩(wěn)定性較好的2-乙?；?1-吡咯啉喹喔啉(2-APQ)衍生產(chǎn)物,通過(guò)加入2-APQ-d4同位素內(nèi)標(biāo),進(jìn)行穩(wěn)定同位素稀釋法校正,HPLC-MS/MS測(cè)定。該分析方法在樣品提取的過(guò)程中,只需要在室溫條件下進(jìn)行,2-AP不會(huì)因發(fā)生降解而損失,避免了由此引起的測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題。方法的LOD和LOQ分別為0.26 μg/kg 和0.79 μg/kg。利用該方法,Jost等測(cè)定了11個(gè)巴斯馬蒂米樣品,2-AP含量為41～356 μg/kg。該方法唯一的不足是衍生化反應(yīng)需要在避光條件下反應(yīng)24 h。基于Rungsardthong等[49]的研究結(jié)果(2-AP在乙醇中于14天內(nèi)能夠保持較好的穩(wěn)定性)以及Hien等[25]直接以純乙醇為溶劑成功實(shí)現(xiàn)大米中2-AP提取的經(jīng)驗(yàn),我們開(kāi)發(fā)了超聲輔助-乙醇提取-超高效液相色譜-MS/MS法測(cè)定香米中2-AP的方法,該方法無(wú)需對(duì)2-AP進(jìn)行衍生,即可獲得準(zhǔn)確可靠的測(cè)定結(jié)果,相關(guān)研究結(jié)果待正式發(fā)表。

綜上所述,GC分離分析仍是2-AP檢測(cè)的主流方法,特別是具有更強(qiáng)分離能力和定性能力的多維色譜與串聯(lián)質(zhì)譜及飛行時(shí)間質(zhì)譜的組合應(yīng)用,將使得復(fù)雜樣品基質(zhì)中2-AP的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確;而新型基于衍生化反應(yīng)的HPLC-MS/MS分析方法的應(yīng)用,將可有效解決采用GC分析檢測(cè)時(shí)2-AP在高溫條件下前處理過(guò)程中損失或新生成的問(wèn)題;電子鼻測(cè)定法和嗅覺(jué)測(cè)定法由于本身靈敏度的限制,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中大多需要和質(zhì)譜精確定量的方法相結(jié)合,更多地依賴于化學(xué)計(jì)量學(xué)及相關(guān)算法模型的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

2.5 定性、定量方法

對(duì)于2-AP的定性,無(wú)論是采用基于GC分離分析還是LC分離分析的檢測(cè)方法,絕大多數(shù)情況下均以2-AP在色譜柱上的保留時(shí)間定性,即通過(guò)樣品中2-AP的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的比對(duì),確認(rèn)是否存在2-AP。在采用質(zhì)譜作為檢測(cè)器時(shí),還可輔以全掃描條件下碎片離子的豐度特征與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中2-AP進(jìn)行匹配或是精確質(zhì)量數(shù)分析而進(jìn)行定性。

而對(duì)于香米中2-AP的定量,由于基質(zhì)的影響不容忽視,除采用空白基質(zhì)加標(biāo)法進(jìn)行校正之外,使用最多的還是內(nèi)標(biāo)法,常用的非同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物主要有2,6-二甲基吡啶(2,6-DMP)、2,4,6-三甲基吡啶(TMP)及2-乙?；量?2-Pyr)等。選擇TMP作為內(nèi)標(biāo)主要是因?yàn)樗c2-AP具有相似的物理化學(xué)性質(zhì),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在GC柱上與2-AP的保留時(shí)間比較接近。1983年,Buttery等[21]首次利用TMP作為內(nèi)標(biāo),測(cè)定了數(shù)十種不同類型香米煮熟后2-AP的含量,其含量為0.006～0.09 mg/kg。之后,TMP作為測(cè)定2-AP的內(nèi)標(biāo),被應(yīng)用于多項(xiàng)研究中。但也有一些研究表明,在采用GC柱分離時(shí),TMP會(huì)和樣品中的組分發(fā)生峰重疊的現(xiàn)象,因此,與TMP性質(zhì)類似的2,6-DMP有時(shí)也會(huì)被用作2-AP測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物[15],相似地,還有研究人員采用與2-AP性質(zhì)更為接近的2-Pyr為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量校正[41]。

由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法相對(duì)于以上內(nèi)標(biāo)法而言,在對(duì)2-AP進(jìn)行定量分析時(shí)具有更加明顯的優(yōu)勢(shì),近年來(lái)已成為香米中2-AP測(cè)定時(shí)所采用的主要方法。穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法是將一定量被測(cè)物質(zhì)的同位素異構(gòu)體加入試樣中,待其與被測(cè)物質(zhì)均勻混合后,在同一樣品前處理過(guò)程中被提取、凈化,并進(jìn)入相應(yīng)的儀器,根據(jù)質(zhì)量數(shù)的微小差異進(jìn)行定性和內(nèi)標(biāo)法校正,從而計(jì)算出待測(cè)物的含量。2-AP最常用的同位素內(nèi)標(biāo)為氘代的2-AP-(CD3)和13C標(biāo)記的2-AP-(13CH3), Yoshihashi等[50]使用13C標(biāo)記的2-AP為內(nèi)標(biāo)對(duì)香米中2-AP的含量進(jìn)行了校正分析,并用2-AP-(CD3)為內(nèi)標(biāo)分析校正了水稻幼苗中的2-AP。Yin等[51]使用13C標(biāo)記的2-AP作為內(nèi)標(biāo),采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS聯(lián)用的方法,對(duì)不同包裝的香米中的2-AP含量做了調(diào)查。Hien等[25]則采用13C標(biāo)記的2-AP作為內(nèi)標(biāo),GC-MS法對(duì)亞洲香米中的2-AP含量進(jìn)行了分析,并和嗅覺(jué)測(cè)試結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行了研究。Maraval等[52]以2-AP-d2(吡咯環(huán)上的5號(hào)位2個(gè)H被D取代)為內(nèi)標(biāo),結(jié)合氣相色譜-正離子化學(xué)電離-離子阱質(zhì)譜(GC-PCI-IT-MS/MS)實(shí)現(xiàn)了香米中2-AP的精確測(cè)定。在定量分析過(guò)程中,當(dāng)采用GC-MS相關(guān)的分析方法對(duì)2-AP進(jìn)行測(cè)定時(shí),通常采用SIM法,即采集某一用于定量分析離子的信號(hào)(如m/z111、83、68),與內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)進(jìn)行比值分析,再與2-AP的含量建立定量關(guān)系曲線。但有些研究人員為了減少可能的干擾或增強(qiáng)檢測(cè)的特異性,采用多個(gè)子離子信號(hào)總和的方式進(jìn)行定量[34];而采用HPLC-MS/MS對(duì)樣品中的2-AP進(jìn)行測(cè)定時(shí),則充分發(fā)揮多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的優(yōu)勢(shì),通過(guò)對(duì)2-AP衍生產(chǎn)物2-APQ及同位素內(nèi)標(biāo)2-APQ-d4所產(chǎn)生的多個(gè)定性、定量離子的同時(shí)監(jiān)測(cè),實(shí)現(xiàn)了2-AP的精確測(cè)定[48]。在采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析時(shí),如何保證加入到樣品中的同位素標(biāo)記的2-AP和樣品中本身含有的2-AP能夠完全從樣品質(zhì)基中釋放出來(lái)也需要引起注意,Cadwallader等[53]通過(guò)選擇合適的萃取劑和長(zhǎng)達(dá)120 min的萃取時(shí)間,獲得了最大的萃取效率和滿意的測(cè)定結(jié)果。

3 結(jié)論與展望

2-乙酰基-1-吡咯啉作為香米香味成分的生物標(biāo)志物,因其含量的高低直接影響香米的香味程度并對(duì)其價(jià)值起到一定的決定性作用,在香米的進(jìn)出口貿(mào)易、香稻的呈香機(jī)理、遺傳育種及農(nóng)業(yè)水肥管理、米香味風(fēng)味成分的開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域,開(kāi)展2-AP精準(zhǔn)檢測(cè)方法的研究,具有重要意義。由于食品樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,以及2-AP本身的不穩(wěn)定性和高溫前處理過(guò)程中可能會(huì)生成的特點(diǎn),在對(duì)樣品中的2-AP進(jìn)行提取、凈化、富集等前處理時(shí),需要仔細(xì)評(píng)估前處理過(guò)程對(duì)最終測(cè)定結(jié)果的可能影響,目前應(yīng)用較多的是SPME法和傳統(tǒng)溶劑萃取法,隨著SPME技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及能夠有效從稻米樣品中提取2-AP的乙醇溶劑萃取法的開(kāi)發(fā),新型SPME法和乙醇萃取法將會(huì)在未來(lái)的檢測(cè)中越來(lái)越多地被應(yīng)用;在測(cè)定方法的選擇上,氣相色譜法、氣相色譜-嗅覺(jué)測(cè)定法、電子鼻法等因易受基質(zhì)干擾、重現(xiàn)性和靈敏度還有待進(jìn)一步提高等問(wèn)題,其未來(lái)的實(shí)際應(yīng)用將越來(lái)越有限,而能夠通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法進(jìn)行校正的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法特別是LC-MS/MS法應(yīng)成為精準(zhǔn)檢測(cè)的首選方法。未來(lái)的研究方向要進(jìn)一步圍繞樣品中2-AP的高效提取前處理方法及精準(zhǔn)定量?jī)x器分析方法的開(kāi)發(fā)展開(kāi)。