李俊樂 高 惠 滕麗微，2 劉振生，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040)

腸道菌群(gut microorganism)是動(dòng)物腸道內(nèi)復(fù)雜的，具有動(dòng)態(tài)變化的微生物群落[1]。腸道菌群從動(dòng)物一出生就開始在其腸道繁殖，其種類繁多且復(fù)雜多樣，經(jīng)過長期的進(jìn)化，宿主的腸道中形成一個(gè)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)平衡的體系[2]。在動(dòng)物腸道中，腸道菌群的數(shù)量與種類并不固定，外界環(huán)境和宿主自身都會(huì)對(duì)上述動(dòng)態(tài)平衡產(chǎn)生影響，從而影響腸道微生物的多樣性，腸道菌群與多種外界因素相互作用共同影響宿主的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)及生理健康等方面[3-4]。腸道菌群是宿主快速適應(yīng)外界環(huán)境的重要因素。研究表明食草動(dòng)物獨(dú)特的腸道為植物纖維素降解形成一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，而草食動(dòng)物的腸道菌群具有特殊的代謝特點(diǎn)，能分泌大量的纖維素分解酶類[5-6]。反芻動(dòng)物更是如此，這種獨(dú)特的腸道菌群和腸道有助于宿主適應(yīng)高纖維食物[7]。因此反芻動(dòng)物腸道菌群與其他大多數(shù)動(dòng)物腸道菌群相比，有更突出的作用[8]。隨著近年來學(xué)者開始對(duì)動(dòng)物腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)，菌群多樣性等方面進(jìn)行深入研究[9-10]。野生哺乳動(dòng)物腸道菌群的研究已經(jīng)從簡單的菌群組成分析深入到其功能分析，但對(duì)腸道微生物群落中的功能菌及其機(jī)制仍有待解決。因此，對(duì)腸道菌群的組成和多樣性的研究仍是重要內(nèi)容。

馬鹿(Cervuselaphus)是國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物[11]，中國主要有阿拉善亞種(C.alashanicus)、塔里木亞種(C.e.yarkandensis)、天山亞種(C.e.songari-cus)、阿爾泰亞種(C.e.sibiricus)、東北亞種(C.e.xanthopygus)、甘肅亞種(C.e.kansuensis)、四川亞種(C.e.macneilli)和西藏亞種(C.e.wallichii)8個(gè)亞種[12]。目前阿拉善馬鹿僅分布于寧夏和內(nèi)蒙古交界的賀蘭山中段，是我國唯一幸存的該亞種的有效種群。劉振生等[13-14]和駱穎等[15]已對(duì)賀蘭山地區(qū)阿拉善馬鹿的生境選擇進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，喬付杰等[16]對(duì)該地區(qū)野生阿拉善馬鹿分子學(xué)進(jìn)行研究。但目前關(guān)于野生阿拉善馬鹿腸道微生物的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究通過對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群進(jìn)行研究，探索其個(gè)體間腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)之間的差異，對(duì)阿拉善馬鹿更科學(xué)合理的保護(hù)提供理論支持。

1 研究地概況

賀蘭山位于寧夏回族自治區(qū)與內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處(38°21′—39°22′N，105°49′—106°42′E)，分屬于內(nèi)蒙古自治區(qū)賀蘭山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和寧夏賀蘭山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。處于北溫帶向荒漠過渡地帶，是一條重要的自然地理分界線[17]。賀蘭山地處內(nèi)陸，是典型的大陸性季風(fēng)氣候，夏季較短，冬季漫長。賀蘭山日照時(shí)間較長，年平均日照時(shí)數(shù)為2 800—3 000 h。賀蘭山海拔較高，平均海拔在2 000—3 000 m。賀蘭山地區(qū)各月份降水量有明顯差異，最低降水量和最高降水量分別為187.6 mm和627.5 mm，年平均降水量為420 mm[18-19]。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

2017年2—4月初在賀蘭山地區(qū)采集野生阿拉善馬鹿群體的糞便樣本98份。采集糞便樣品時(shí)為防止交叉感染，每采集一個(gè)樣本，換一副一次性PE手套。將采集的糞便樣本放入95%的無水乙醇中保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后放入-80℃冰箱保存。

2.2 個(gè)體鑒定

本實(shí)驗(yàn)使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA，實(shí)驗(yàn)方法詳見說明書。將提好的DNA分成兩份，一份放置于-20 ℃，用于下一步擴(kuò)增，一份放置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?0對(duì)高度多態(tài)的微衛(wèi)星引物(RT1、BM888、HAUT14、CSSM19、T156、BMS1248、T530、DM45、CSRM602、IOBT9651)對(duì)所有樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，抽樣時(shí)排出3對(duì)重復(fù)個(gè)體。最終選取20份DNA質(zhì)量較高的糞便樣品，進(jìn)行后續(xù)分析。

樣品編號(hào)分別為WA1、WA2、WA3、WA4、WA5、WN1、WN2、WN3、WN4、WN5、WA6、WA7、WA8、WA9、WA10、WN6、WN7、WN8、WN9、WN10。

2.3 高通量測(cè)序

利用高通量測(cè)序技術(shù)，在保證樣品濃度一致和測(cè)序量相同的條件下，在Miseq 2×300 bp平臺(tái)上，對(duì)20份阿拉善馬鹿樣品進(jìn)行16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的序列去除嵌合體和靶向區(qū)域外序列，得到有效序列。然后，將具有高度相似性(97%)的有效序列進(jìn)行OUT劃分，并繪制韋恩圖。通過與數(shù)據(jù)庫的對(duì)比，進(jìn)行物種分類分析，得到樣品所具有的菌群。Alpha 多樣性通過Ace、Chao1、Shannon和Simpsoon 4個(gè)指標(biāo)來衡量菌群得豐富性，繪制稀釋曲線來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量的合理性。一般來說，ACE和Chao1指數(shù)越大，說明群落的豐富度越高，Shannon指數(shù)越大菌群的豐富度越高，Simpsoon指數(shù)越大，菌群的豐富度越低。主成分分析(PCA)法，是以樣本間差異性最大的兩個(gè)因素分別為橫縱坐標(biāo)繪制PCoA聚類圖。樣品間距離越近，則說明樣本間菌群相似性越高。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品中的序列和OTU數(shù)目

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)20份樣品便進(jìn)行16S RNA測(cè)序。共獲得1 564 112條序列，有效序列1 399 562條，平均每個(gè)樣品中含有78 205.6條序列，69 978.1條有效序列。基于相似度>97%的原則，將獲得的有效tags序列進(jìn)行聚類，共獲得2 740個(gè)OTUs，平均每個(gè)樣品含有137個(gè)OTUs(表1)。其中，有效序列數(shù)量最高的是WA4有107 484條有效序列，最低的是WN7有37 569條有效序列，二者相差69 915條。韋恩圖中重疊部分為所有樣品共有的OUT數(shù)目，由圖2可知20個(gè)樣品中共有110個(gè)OTUs。

3.2 Alpha 多樣性分析

通過Alpha 多樣性分析指數(shù)對(duì)20份樣品進(jìn)行豐富度和多樣性比較。從圖2可以看出，隨著測(cè)試深度的不斷加深，稀釋曲線從不斷上升，直至趨于平緩，說明樣品的測(cè)序深度比較合理。

Alpha多樣性分析指數(shù)分析結(jié)果說明(表2)，樣品菌群的豐富度和多樣性都相對(duì)較高。20份樣品中菌群豐富度指數(shù)相對(duì)較高的為WN2(Ace 3 132.50，Chao1 2 750.16)和WA1(Ace 3 028.42，Chao1 2 580.29)，相對(duì)較低的為WA3(Ace 2 106.89，Chao1 2 011.40)和WA5(Ace 2 217.13，Chao1 1 892.97)。樣品中Shannon指數(shù)相對(duì)較高的為WN7(5.82)和WN8(5.85)，相對(duì)較低的WA5(4.27)。樣品中Simpsoon指數(shù)相對(duì)較高的為WA5(0.06)和WN1(0.04)，相對(duì)較低的為WN8(0.009)。樣品的覆蓋度都在98.48%以上，說明測(cè)序結(jié)果足以充分地反映了樣品的真情況。

表1 樣品中有效序列及OUT數(shù)量

圖1 OTUs韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTUs

表2 馬鹿腸道微生物多樣性指數(shù)

Tab.2 Intestinal microbial diversity index of red deer

3.3 物種注釋

在門水平和屬水平上對(duì)樣品進(jìn)行物種注釋，20個(gè)樣品共獲得24個(gè)菌門，283個(gè)菌屬。

在門水平上，含量大于1%的菌門有5個(gè)(圖3)，分別是厚壁菌門(Firmicutes)，(76.71±14.71)%、擬桿菌門(Bacteroidetes)，(14.16±7.92)%、變形菌門(Proteobacteria)，(3.51±10.38)%、疣微菌門(Verrucomicrobia)，(1.92±2.37)%、放線菌門(Actinobacteria)，(1.33±2.14)%。

在屬水平上，含量大于1%的菌屬有11個(gè)(圖4)，分別為孢子桿菌屬(Sporobacter)，(7.38±3.61)%、擬桿菌屬(Bacteroides)，(4.15±1.67)%、梭菌屬系列(ClostridiumIV、ClostridiumXlV)，(3.63±1.44)%、羅氏菌屬(Roseburia)，(3.00±1.74)%、胃瘤球菌(Ruminococcus)，(1.85±0.93)%、奧氏桿菌(Oscillibacter)，(1.80±0.93)%、Intestinimonas(1.56±0.88)%、Akkermansia(1.50±2.88)%、Alistipes(1.49±1.11)%、Flavonifractor(1.47±1.02)%。

圖4 阿拉善馬鹿屬水平菌群相對(duì)豐度Fig.4 Relative microbial abundance composition at the genus level

3.4 主成分分析

根據(jù)樣本OUT的種類及其相對(duì)豐度，對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析，繪制PCoA聚類圖。樣本間越聚集，說明樣本間相似度越高，微生物菌群結(jié)構(gòu)相似度越高。由圖5可知，除樣品WA10和WA3外，其余樣品聚集程度很高，說明樣品間菌群差別不大。

圖5 PCA主成分分析Fig.5 Principal component analysis of PCA

4 討論

與傳統(tǒng)技術(shù)相比高通量測(cè)序技術(shù)能較全面地反應(yīng)樣品中微生物的種類。因此，本文采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)來分析阿拉善馬鹿腸道菌群的構(gòu)成。已有研究表明成年川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)腸道菌群的核心菌門為厚壁菌門和擬桿菌門[20]；大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門(Fusobacteria)[21]；美洲獾(Taxideataxus)腸道菌群的核心菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門[22]；海南坡鹿(Cervuseldiihainanus)腸道菌群的核心菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門[23]，這些研究表明，不同的物種其腸道菌群存在一定的差異。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，20只阿拉善馬鹿的優(yōu)勢(shì)腸道菌群與其他動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)腸道菌群基本相同，主要為厚壁菌門和擬桿菌門。厚壁菌門是馬鹿腸道菌群中含量最高的菌群。厚壁菌門能夠降解食物中的纖維并將分解產(chǎn)物提供給宿主使用，同時(shí)食用高纖維食物也有利于厚壁菌門的積累[24]。擬桿菌門主要功能是幫助宿主降解碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，維持腸道菌群平衡，還可增強(qiáng)宿主免疫性[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖者體內(nèi)的厚壁菌門比瘦者多，而擬桿菌比瘦者少。隨后的一年時(shí)間里，將肥胖者的食物改為低脂肪低碳水化合物后，發(fā)現(xiàn)他們的體重均有降低，同時(shí)厚壁菌的含量降低，擬桿菌的含量升高，說明厚壁菌可以幫助機(jī)體從食物吸取更多的能量[27]。而作為反芻動(dòng)物的野外馬鹿，需要對(duì)纖維、淀粉等物質(zhì)進(jìn)行吸收利用，為自身提供必要的能量。但反芻動(dòng)物的腸胃本身并不能產(chǎn)生相應(yīng)的酶類，不能對(duì)其進(jìn)行降解。因此，腸道菌群對(duì)降解食物中的纖維和淀粉起到了重要的作用。

腸道菌群多樣性與性別、年齡和食性都有一定的關(guān)系[28-29]，因此性別、年齡和食性都會(huì)是造成其差異的原因。對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群多樣性比較發(fā)現(xiàn)，除WA10和WA3外，阿拉善馬鹿腸道菌群多樣性無明顯差別，但其腸道菌群含量占比有一定差別?？赡苁怯捎隈R鹿個(gè)體間體積差異，對(duì)食物的需求量也不同，從而形成了腸道菌群多樣性的差異。研究發(fā)現(xiàn)，同域野外馬麝(Moschuschrysogaster)的核心菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門[30]。且二者在食性上有很大程度的重疊[31]。就野外環(huán)境來說，冬季天氣寒冷，食物匱乏，阿拉善馬鹿和馬麝需要消耗大量的能量來逃避捕獵者，維持體溫等。而腸道菌群會(huì)幫助它們從食物中汲取能量維持身體所需。由此可見，食性會(huì)對(duì)動(dòng)物的代謝等方面產(chǎn)生影響，并能改變動(dòng)物的腸道菌群[29]。本實(shí)驗(yàn)所用到的糞便樣品數(shù)量較少，對(duì)阿拉善馬鹿腸道菌群的更詳細(xì)規(guī)律有待進(jìn)一步研究。