李偉，潘靜，陳曦

石家莊市第一醫(yī)院，石家莊050000

胃癌是全球范圍內常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高，嚴重威脅患者的生命健康。胃癌早期癥狀隱匿，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯失了最佳治療時期，導致患者5年總生存率低，預后較差[1]。目前臨床尚缺乏評估治療療效、預測患者預后的指標，因此尋找能夠有效預測患者預后的生物標志物是胃癌研究領域的熱點。微小RNA(miR)是生物體內一類長度約24個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與基因轉錄后調控，影響目的蛋白表達，進而參與細胞生物學行為，大量研究證實，miR在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用[2]。miR-181是一類重要的miR，在急性髓系白血病[3]、黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]等腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲及化療耐藥中均發(fā)揮重要調控作用。研究表明，miR-33a在結直腸癌[6]、胃癌[7]等惡性腫瘤中呈低表達狀態(tài)，發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的功能。本研究旨在通過檢測分析胃癌組織中miR-181、miR-133a表達，探討其臨床意義，以期為胃癌患者預后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年3月本院行切除術的胃癌患者113例，術中取其胃癌組織及癌旁(距離腫瘤邊緣>3 cm)正常組織樣本?；颊吣?3例，女40例；年齡<60歲64例，≥60歲49例；腫瘤直徑<5 cm 61例，≥5 cm 52例；腫瘤低分化43例，中高分化70例；浸潤深度為黏膜下層59例，漿膜層54例；病理類型為腺癌86例，印戒細胞癌21例，黏液癌6例；有淋巴結轉移67例，無淋巴結轉移46例；有遠處轉移61例，無遠處轉移52例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期76例，Ⅲ～Ⅳ期37例。納入標準：術前未接受放化療等抗腫瘤治療；均經(jīng)病理檢查確診為胃癌；有完整的病歷資料；完成隨訪。排除標準：其他惡性腫瘤；肝腎等重要臟器功能不全；血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾??；全身感染性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181、miR-133a表達檢測 采用實時定量PCR(RT-PCR)技術。將組織樣本至于研缽中，加入少量液氮進行研磨，取70～80 mg組織樣本至EP管中，加入TRIzol溶液1 mL，用電動均漿器充分均漿，依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水，提取組織樣本中RNA。反轉錄試劑盒(Takara，RR037A)將RNA逆轉錄為cDNA，用Applied Biosystem SYBR 試劑盒(Thermo)進行RT-PCR實驗。miR-181正向引物序列：5′-AACATTCAACGCTGTCGGTGAAGT-3′，反向引物序列：5′-ACTTCACCGACAGCGTTGAATGTT-3′；miR-133a正向引物序列：5′-ATAAGAATGCGGCCGCATTCCAAACTAGCAGCACTA-3′，反向引物序列：5′-AGCTTTGTTTAAACTTAACCATTCTAGCTTTTCC-3′；內參U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATA-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 3 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算miR-181及miR-133a相對表達量。

1.3 隨訪 采用電子通訊、門診復查等方式對胃癌患者進行隨訪，隨訪時間從術后開始，隨訪至患者死亡或術后60個月。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181、miR-133a表達比較 胃癌組織及癌旁正常組織中miR-181相對表達量分別為4.593±0.987、1.312±0.367，miR-133a相對表達量分別為0.316±0.137、1.243±0.331。與癌旁正常組織相比，胃癌組織中miR-181相對表達量高，miR-133a相對表達量低，比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.2 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織中miR-181表達與患者性別、年齡、病理類型無關(P均>0.05)，而與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期有關(P均<0.05)；miR-133a表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、病理類型、TNM分期無關(P均>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移有關(P均<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中miR-181、miR-133a表達與患者預后的關系 以miR-181相對表達量中位數(shù)為界，將胃癌患者分為miR-181高表達組56例、miR-181低表達組57例。miR-181高表達組術后5年總生存率為32.14%(18/56)、中位生存時間為(33.21±2.69)個月；miR-181低表達組術后5年總生存率為56.14%(32/57)、中位生存時間為(47.60±2.28)個月。miR-181高表達組術后5年總生存率、中位生存時間均低于miR-181低表達組(P均<0.05)。

以miR-133a相對表達量中位數(shù)為界，將胃癌患者分為miR-133a高表達組56例、miR-133a低表達組57例。miR-133a低表達組術后5年總生存率為29.82%(17/57)、中位生存時間為(35.28±2.48)個月，miR-133a高表達組術后5年總生存率為58.93%(33/56)、中位生存時間為(45.85±2.72)個月。miR-133a低表達組術后5年總生存率、中位生存時間均低于miR-133a高表達組(P均<0.05)。

2.4 胃癌患者預后的影響因素 建立Cox比例回歸模型，以本研究資料為樣本，以預后生存狀況為應變量，賦值生存=1，死亡=0，生存期=t。以前述單因素分析中P<0.10的指標(因素)為自變量?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。結果顯示，影響胃癌患者預后的危險因素有浸潤深度(漿膜層)、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期較高及miR-181高表達、miR-133a低表達(HR均>1，P均<0.05)。見表2。

表2 胃癌患者預后影響因素的Cox回歸模型多因素分析

3 討論

我國胃癌的發(fā)病率很高，且病死率居所有惡性腫瘤之首。據(jù)分析，我國未來幾年的胃癌發(fā)病人數(shù)還將隨著人口的老齡化而不斷增加[8]。盡管近年來醫(yī)療技術取得了飛速發(fā)展，但目前根治性手術仍然是治療胃癌的主要手段。然而許多患者就診時已錯過行根治手術的時機，且并非所有患者都適于采用根治性手術，如何早期診斷胃癌同時正確評估胃癌患者預后，能為正確決定患者臨床診療方案提供重要參考。因此迫切需要尋找有效評估胃癌預后的生物學標志物。

人類成熟miR-181家族包含miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d共4個成熟序列，其基因位于同一條染色體，且呈簇排列，協(xié)同參與靶基因調控[9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-181家族在維持造血細胞自我更新及定向分化等過程中具有重要調控作用[10]；miR-181可抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、促進其凋亡[11]；目前關于miR-181在胃癌發(fā)病及惡性進展中的功能，尚存在較大爭議，如Hashimoto等[12]在胃癌細胞中增加miR-181c表達可顯著抑制胃癌細胞增殖，揭示miR-181c通過抑制細胞增殖在胃癌進展過程中發(fā)揮抑癌基因作用；而余鈞輝等[13]發(fā)現(xiàn),在胃癌AGS細胞中上調miR-181a表達，可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，具有促癌基因特性。本研究結果表明，胃癌組織中miR-181相對表達量高于癌旁正常組織，且其高表達與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結及遠處轉移、TNM分期相關，提示miR-181高表達可能是胃癌誘發(fā)因素之一，且參與并促進胃癌細胞的增殖、上皮間質轉化(EMT)、侵襲、轉移等病理過程。研究證實，miR-181在非小細胞癌中靶向調控Bcl-2基因，抑制細胞增殖[14]；miR-181調控DAX-1基因表達促進前列腺癌細胞增殖[15]，miR-181可能通過調控不同目的基因表達，在不同惡性腫瘤中發(fā)揮截然不同的生物學功能。本研究初步推測miR-181可能直接或間接參與相關基因(Cyclin B1、MMP等)的表達調控[16，17]，促進胃癌細胞增殖、侵襲、轉移等惡性進展過程。后續(xù)將在分子細胞水平，對以上科學假設進行研究和論證。

miR-133a是肌肉組織特異性表達的miRNA，其編碼基因包括miR-133a-1(位于18號染色體)和miR-133a-2(位于20號染色體)，兩者具有相同的成熟序列。近年來研究證實，miR-133a在惡性腫瘤中發(fā)揮至關重要的調節(jié)作用，如miR-133a在乳腺癌中通過靶向負調控LASP1以抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲等作用[18]；而在結腸癌[19]中，miR-133a能夠抑制真核翻譯起始因子eIF4A1等基因表達，抑制癌細胞的遷移，從而發(fā)揮抑癌基因功能。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-133a呈低表達狀態(tài)，且與胃癌腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移相關，與Dong等[20]在胃癌組織中針對miR-133a的研究結論一致。這些臨床病理特征均能夠反映胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲的能力，與前述miR-133a在其他惡性腫瘤中的作用近似。此外，Chen等[21]進行的體外研究也證實，miR-133a能夠通過調控PSEN1基因表達，抑制胃癌細胞EMT過程，而EMT的進展與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關。因此可推斷，miR-133a的表達異常與胃癌的發(fā)生相關；而抑制miR-133a的表達將促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲，進而促進胃癌的惡性程度，即miR-133a在胃癌的起病、進展過程中起抑癌基因樣作用。

Kaplan-Meier生存曲線結果表明，與miR-181低表達組、miR-133a高表達組相比，miR-181高表達組、miR-133a低表達組患者的預后均較差。提示miR-181、miR-133a具有預測胃癌患者預后的潛能。Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、較高TNM分期、miR-181高表達、miR-133a低表達是影響胃癌患者預后的危險因素，miR-181、miR-133a可能通過調節(jié)胃癌細胞的侵襲、遷移等過程，導致患者預后不良。檢測胃癌患者手術切除組織樣本中miR-181、miR-133a表達，有利于輔助評估患者預后。

綜上所述，胃癌組織中miR-181高表達、miR-133a低表達，且均與患者較差的臨床病理特征相關。miR-181高表達、miR-133a低表達患者的預后均較差，且均為影響胃癌患者預后的危險因素。檢測患者手術切除組織中miR-181、miR-133a表達可能有利于患者預后的判斷。然而本研究為單中心研究，樣本較少，數(shù)據(jù)離散程度較大，可能導致miR-181、miR-133a表達與患者某些臨床病理特征的分析結果無統(tǒng)計學意義，后續(xù)將進一步增加樣本量進行檢測和分析。