邊夢(mèng)雪，于志勇

1濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250117；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；3山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性新發(fā)癌癥的發(fā)病率和病死率中均居首位[1]。三陰性乳腺癌(TNBC)是一種異質(zhì)性疾病，缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)。TNBC僅占所有乳腺癌的15%左右，是最具侵襲性的乳腺癌亞型之一[1]。雖然新的治療方法如分子靶向治療、免疫治療等可改善部分TNBC患者的預(yù)后，但化療仍占據(jù)著無(wú)可替代的地位[2]。影響化療成敗的關(guān)鍵因素之一是腫瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)耐藥。尋找聯(lián)合應(yīng)用的藥物來(lái)克服腫瘤耐藥性、降低化療藥物毒副作用可能是一種有效方法。香附為莎草科多年生草本植物莎草的干燥根莖，可單獨(dú)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)，有顯著的神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗DNA損傷、抗菌和抗糖尿病等作用[3,4]。關(guān)于香附治療乳腺癌的報(bào)道很少。研究發(fā)現(xiàn)，中藥可有效控制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)[5]。香附乙醇提取物可誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚[6]。自噬通過(guò)介導(dǎo)溶酶體依賴(lài)途徑中的異常蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞器降解維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。乳腺癌細(xì)胞耐藥可能由于其自噬活性的增加。有研究證實(shí)，抑制自噬可改善非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞化療和靶向治療之間的拮抗作用[7]?？梢?jiàn)，抑制自噬可使耐藥細(xì)胞恢復(fù)敏感性，增加化療藥物的細(xì)胞毒性。2019年4～6月，本研究選取TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231，觀察香附提取物處理后對(duì)表柔比星抗腫瘤效應(yīng)的影響，探討香附提取物應(yīng)用于抗TNBC治療的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 香附干品購(gòu)自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司。表柔比星購(gòu)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司。MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。CCK-8試劑盒購(gòu)自濟(jì)南檸檬生物技術(shù)有限公司；兔抗人Actin、Bax、Beclin-1單克隆抗體、鼠抗兔IgG二抗均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)美谷分子儀器有限公司，Gel Doc XR+蛋白凝膠成像儀購(gòu)自上海涵飛醫(yī)療器械有限公司，Calibur流式細(xì)胞購(gòu)自上海普迪生物技術(shù)有限公司。

1.2 香附提取物提取 將香附干品切成小塊，與95%乙醇以1∶10放入燒瓶中，室溫下在暗室密封12 h，于80 ℃的水浴中加熱2 h獲得上清液1；加入與上清液1等量的95%乙醇，再次煮沸混合物2 h，得到上清液2，將提取的上清液2過(guò)濾，過(guò)濾的上清液2在 40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，凍干后得到棕黃色粉末，為香附乙醇提取物，在二甲基亞砜中再懸浮至400 mg/mL，稀釋后濾器過(guò)濾，于-80 ℃凍存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，于含有10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)箱，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞液每周傳代2～3次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度85%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL,分別加入劑量為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mg/mL的香附提取物，0、0.75、1.5、3 μg/mL的表柔比星，香附0.4 mg/mL(接近半數(shù)致死量)+表柔比星1.2 μg/mL(接近半數(shù)致死量)處理48 h。

1.4 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。藥物處理48 h，收集細(xì)胞，加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率以及半數(shù)抑制濃度，細(xì)胞存活率(%)=加藥組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。藥物處理48 h，收集細(xì)胞，用胰蛋白酶收集，含血清培養(yǎng)基中和后離心(1 000 r/min，3 min)，用冷PBS洗滌2次，于緩沖液中再懸浮，加入AnnexinV-FITC、PI各5 μL，暗室孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率?；罴?xì)胞不能被AnnexinV-FITC、PI染色，早期凋亡細(xì)胞因卵磷脂酰絲氨酸暴露及有完整細(xì)胞膜，故呈AnnexinV-FITC染色陽(yáng)性及PI染色陰性，晚期凋亡率細(xì)胞呈AnnexinV-FITC染色陰性及PI染色陽(yáng)性。

1.6 細(xì)胞克隆形成率檢測(cè) 采用細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)。藥物處理48 h，收集細(xì)胞，PBS沖洗2遍，換新鮮培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，棄上清液后用PBS清洗，每孔加入的Carnoy固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)2 mL固定20 min，然后用自來(lái)水慢慢洗凈，每孔加入結(jié)晶紫染色液2 mL室溫靜置20 min，回收染液，沖洗干凈后烘箱風(fēng)干計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞內(nèi)凋亡標(biāo)志蛋白Bax、抗凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2及自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。藥物處理48 h，收集細(xì)胞，棄原培養(yǎng)基。將貼壁細(xì)胞用冷PBS在冰上洗滌，并在含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液中裂解20 min。上清液于4 ℃以12 000 r/min離心20 min，并按照說(shuō)明對(duì)上清液進(jìn)行BCA定量，然后與蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，將提取的樣品蛋白置于EP管保存于-80 ℃冰箱備用。用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，100 V的電壓轉(zhuǎn)膜60 min轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶將膜封閉1 h，1×TBST洗膜3遍，一抗BAX(2772T)、Bcl-2(4223T)、Beclin-1 (D40C5)、β-Actin (13E5)，稀釋比例1∶1 000)于4 ℃下孵育過(guò)夜，以β-Actin為內(nèi)參。次日TBST洗膜后在室溫下與二抗goat anti-rabbit IgG(1∶5 000)孵育1 h。配置ECL發(fā)光液使用凝膠成像儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。使用Image J軟件檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 香附提取物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL香附提取物處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，細(xì)胞存活率分別為(95.08±5.36)%、(82.47±8.45)%、(69.10±7.25)%、(58.72±7.26)%、(47.00±6.38)%、(32.00±5.21)%。經(jīng)0、0.5、0.75、1.5、2 μg/mL表柔比星處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，細(xì)胞存活率分別為(97.08±3.56)%、(73.27±8.45)%、(63.22±7.38)%、(56.72±5.16)%、(43.00±4.32)%。0.4 mg/mL香附提取物聯(lián)合0、0.5、0.75、1.5、2 μg/mL表柔比星處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，細(xì)胞存活率分別為(96.18±.3.16)%、(63.21±8.35)%、(58.72±7.42)%、(52.32±5.23)%、(32.21±4.22)%。香附提取物聯(lián)合表柔比星處理后，MDA-MB-231細(xì)胞存活率低于二者單獨(dú)處理(P均<0.05)。

2.2 香附提取物與表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 香附提取物+表柔比星處理后，MDA-MB-231細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均高于二者單獨(dú)處理(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 香附提取物與表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2.3 香附提取物與表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成的影響 經(jīng)0.4 mg/mL香附提取物、1.2 μg/mL表柔比星、0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星處理后，MDA-MB-231克隆形成率分別為(65.32±6.41)%、(69.52±5.41)%、(45.68±8.31)%。經(jīng)0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星處理后MDA-MB-231克隆形成率低于二者單獨(dú)處理(P均<0.05)。

2.4 香附提取物與表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)0.4 mg/mL香附提取物+1.2 μg/mL表柔比星處理后MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)高于二者單獨(dú)處理，Bcl-2 、Beclin-1蛋白表達(dá)低于二者單獨(dú)處理(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 香附提取物與表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

由于TNBC缺少內(nèi)分泌治療和靶向治療的機(jī)會(huì)，易發(fā)生器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，化療是治療TNBC的主要手段[8]。表柔比星是治療TNBC最有效的化療藥之一，主要通過(guò)破壞細(xì)胞核基因并干擾其轉(zhuǎn)錄翻譯來(lái)殺死癌細(xì)胞，可與細(xì)胞中DNA發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而抑制腫瘤細(xì)胞的功能，作用強(qiáng)且效果快[9]。但腫瘤耐藥性影響了TNBC的化療效果。

中醫(yī)藥有著數(shù)千年的發(fā)展歷史，越來(lái)越多的研究試圖從中藥中獲取高效的抗腫瘤化合物。已有文獻(xiàn)證實(shí)，香附提取液可以殺死不同的癌細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞HeLa、肝癌細(xì)胞Hepg2等[10]。從香附的乙酸乙酯提取物中分離得到的11,12-二羥基-4-烯-3-酮對(duì)卵巢癌細(xì)胞有顯著的殺傷作用[11]。

本研究中香附提取物的主要成分為香附芳香酮、吲哚、異丙內(nèi)酯混合物。香附提取物的總黃酮和乙酸乙酯提取物能抑制黃嘌呤氧化酶，防止脂質(zhì)過(guò)氧化引起的dDNA損傷，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[12]。香附提取物可改善過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，延長(zhǎng)壽命，并減少神經(jīng)元和年齡相關(guān)疾病[13]。從香附中分離到的6-乙酰氧基香附烯可引起卵巢癌細(xì)胞caspase依賴(lài)性凋亡[14]。在古代文獻(xiàn)中，香附被磨成粉末，與姜汁、酒混合外敷治療乳腺癌[15]。對(duì)于香附提取物治療TNBC的研究較少，且作用機(jī)制并不明確。本研究結(jié)果表明，香附提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，香附提取物的加入增強(qiáng)了表柔比星的細(xì)胞毒性，聯(lián)合用藥后細(xì)胞凋亡率升高，克隆形成率降低。

本研究中香附提取物聯(lián)合表柔比星處理的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Bax表達(dá)升高，抗凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2表達(dá)減少。Bcl-2與其同源結(jié)構(gòu)域(BH3)結(jié)合，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。通路起始于BH3蛋白的誘導(dǎo)或激活，這有助于Bcl-2的失活以及激活Bax、BAK，Bax和BAK被激活，線粒體分裂增加，Caspase依賴(lài)的凋亡被激活[16]。部分化療藥物和靶向治療可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而保護(hù)細(xì)胞免受藥物誘導(dǎo)的DNA損傷，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活。表柔比星可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬[17]。有研究報(bào)道，香附提取物誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與活性氧產(chǎn)生及磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、促分裂原活化蛋白激酶途徑無(wú)關(guān)，對(duì)其凋亡機(jī)制也未進(jìn)一步研究[18]。本研究中香附提取物聯(lián)合表柔比星處理后MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)降低。提示香附提取物可能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬增強(qiáng)表柔比星對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的毒性作用。香附提取物在體外誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞凋亡，作為自噬抑制劑可增強(qiáng)表柔比星藥物毒性。這為用香附提取物作為自噬抑制劑克服自噬耐藥和增強(qiáng)表柔比星對(duì)TNBC的抗癌作用提供了證據(jù)。

本研究在體外實(shí)驗(yàn)階段初步驗(yàn)證了香附提取物促進(jìn)表柔比星引起的細(xì)胞凋亡，但其確切的作用機(jī)制及效果需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。