曹會(huì)，劉杰，劉志剛

（深圳大學(xué) 過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東深圳518055）

白酒是以糧食、谷物為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾等工序制得的蒸餾酒[1]，而醬香型白酒是深受消費(fèi)者喜愛(ài)的獨(dú)特香型之一。研究顯示，醬香型白酒中含有多種風(fēng)味物質(zhì)，如酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)以及酚類(lèi)等[2-3]。部分風(fēng)味化合物具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎等[4-5]。NO 是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成的，調(diào)節(jié)NO 的生成及一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)被認(rèn)為是治療炎性疾病的重要手段[6]。IL-6、IL-8 是重要的促炎細(xì)胞因子，異常釋放會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多器官細(xì)胞代謝障礙和功能損害[7]，而IL-10 是重要的抗炎細(xì)胞因子[8]。研究顯示，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻擊約 30 min 后即可見(jiàn)促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-8）的大量釋放，而IL-10 則在 LPS攻擊后6 h～8 h 達(dá)到高峰，較促炎細(xì)胞因子反應(yīng)延遲[9]。腫瘤壞死因子（TNF-α），又稱(chēng)前炎癥細(xì)胞因子，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[10]。

緊密連接蛋白Occludin 和ZO-l 是構(gòu)成腸道上皮連接復(fù)合體多蛋白復(fù)合物的主要結(jié)構(gòu)蛋白[11]。研究表明，腸道上皮緊密連接的完整性受損及腸道滲透性增加與許多胃腸道疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。腸道上皮細(xì)胞在受到刺激或發(fā)生炎癥時(shí)，其緊密連接完整性會(huì)出現(xiàn)一定的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜屏障功能下降，最終會(huì)使腸道細(xì)菌或其它異物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[12]。

醬香型白酒是經(jīng)高粱等多種糧食作物經(jīng)過(guò)發(fā)酵等多種工序獲得的純天然性酒精飲品，不論是傳統(tǒng)中醫(yī)中藥研究還是現(xiàn)代藥理學(xué)研究，結(jié)果均顯示其具有廣泛的藥理作用，而白酒在抗炎及對(duì)腸道疾病方面的藥效也具有較多的報(bào)道。但由于酒精的存在及白酒中其它有效成分的含量甚微，加之提取分離純化等技術(shù)條件的制約，使得人們對(duì)白酒中非乙醇成分的研究較少。本研究通過(guò)氯仿萃取及冷凍干燥的方式獲得醬香型白酒中的非乙醇活性物質(zhì)，并通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析其化合物組成，建立LPS誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞炎癥模型，探討醬香型白酒中非乙醇物質(zhì)（maotai-flavor liquor extract，MTE）對(duì)模型細(xì)胞及細(xì)胞緊密連接蛋白的作用。從而為闡明MTE 對(duì)LPS誘導(dǎo)的IEC-6 的細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)及細(xì)胞間緊密連接蛋白等的作用及機(jī)制提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠小腸隱窩上皮IEC-6 細(xì)胞株：美國(guó)ATCC 公司；醬香型白酒：貴州茅臺(tái)集團(tuán)；LPS：Sigma 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈霉素：HyClone 公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：廣州瑞舒生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基：HyClone 公司；0.25%胰蛋白酶（≥180 U/mg）：Gibco 公司；IL-6、IL-8、TNF-α、NO、IL-10 試劑盒：碧云天生物科技有限公司；ExScript TM RT-PCR Kit 試劑盒：TaKaRa 公司。

1.2 主要儀器

api 3000 液質(zhì)聯(lián)用儀 HPLC-MS/MS：ABSCIEX 公司；FORMA 3111 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：賽默飛公司；1510 多功能酶標(biāo)儀：賽默飛公司；CFX96PCR 儀：Bio-Rad 公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞德儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 MTE 的分離及 HPLC-MS 分析

500 mL 分液漏斗中加入100 mL 醬香型白酒、40 mL水和150 mL 氯仿，震蕩搖勻，靜置，分離氯仿層，重復(fù)3 次，合并氯仿層。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（0 ℃）除去氯仿獲得有機(jī)層化合物。真空凍干機(jī)凍干水層，獲得水層化合物，合并有機(jī)層及水層化合物為MTE，-20 ℃避光保存。HPLC-MS 分析方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行[13]。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %的FBS、105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、90%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，隔天換液。

細(xì)胞濃度2×105/mL 加入含有0.10 mg/mL 的化合物的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS培養(yǎng)4 h，CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

細(xì)胞濃度2×105/mL 加入含有0.20 mg/mL 的白酒（53 度）、MTE、α-雪松醇、乙醇 ∶水（體積比 53 ∶47）的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，CCK8 檢測(cè)化合物對(duì)增殖能力及流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。

細(xì)胞濃度2×105/mL 加入含有0.20 mg/mL 的白酒（53 度）、MTE、α-雪松醇、乙醇/水（體積比為 53 ∶47）的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測(cè)定 NO、TNF-α 等相關(guān)炎癥因子濃度。細(xì)胞裂解后收集裂解物，提取RNA，采用定量PCR 測(cè)定TNF-α、IL-10 等基因的相對(duì)表達(dá)。

1.3.3 RNA 提取和 cDNA 的合成

培養(yǎng)細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，加入0.50 mL 細(xì)胞裂解液，收集于2.0 mL 離心管，室溫25 ℃靜置2 min 后加入0.10 mL 氯仿，劇烈振蕩 15 s 混勻，靜置 2 min～3 min。在4 ℃1.2×104g 離心3 min，取上層水相加入等量異丙醇，漩渦振蕩，室溫 25 ℃放置 10 min；1.2 × 104g 離心10 min，棄上清，沉淀中加入1.0 mL 75%乙醇洗滌，室溫25 ℃干燥后加入30 μL 的DEPC 水溶解即得總RNA，其 OD260/280為 1.8～2.0[14]。cDNA 的合成使用SYBR@PrimeScriptTMRT-PCR Kit，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 PCR擴(kuò)增

IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10、Occludin、ZO-1 和 βactin cDNA 參照 GenBank 中公布的序列，利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并合成。試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR Green I 染料法，按照ExScriptTMRTPCR Kit 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)在定量PCR 儀進(jìn)行。總反應(yīng)體積 10.0 μL 體系：SYBR-Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，cDNA 模版 1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 10 s，變性 95 ℃5 s，熒光檢測(cè) 72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對(duì)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，對(duì)MTE 處理效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。p ＜0.05 定為具有顯著性差異，結(jié)果均以 Mean±SEM 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTE的分離提取及化合物分析

MTE 中相關(guān)化合物對(duì)IEC-6 細(xì)胞增殖能力的影響見(jiàn)表1。

本試驗(yàn)中100 mL 白酒經(jīng)萃取及冷凍干燥，最終獲得 MTE 0.75 mg。HPLC-MS 分析，MTE 多為多元醇、不飽和脂肪酸及其酯類(lèi)化合物、吡嗪類(lèi)化合物及含有苯環(huán)的芳香族化合物，選出其中26 個(gè)化合物及MTE 進(jìn)行體外抗炎活性研究。

2.2 MTE對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖能力的影響

腸上皮細(xì)胞是腸黏膜機(jī)械屏障的主要組成部分，可分泌細(xì)胞因子和趨化因子，在腸道免疫系統(tǒng)中起重要作用，該細(xì)胞受損將會(huì)增加腸道黏膜的滲透性，從而增加腸道LPS 的遷移[15]。0.10 mg/mL MTE 化合物預(yù)處理細(xì)胞24 h 后，加入1.0 mg/L LPS 培養(yǎng)4 h，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。相比于正常（細(xì)胞增殖能力設(shè)為100%）組，LPS 組細(xì)胞增殖能力顯著下降（83.3%，p＜0.05）。分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分化合物可顯著的降低由LPS 誘導(dǎo)引起的細(xì)胞增殖能力降低。與LPS 組相比，MTE-2、3、5 及 11 與 IEC-6 細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h 后，與LPS 組相比，細(xì)胞增殖能力分別提高13.2%，11.9%，10.3%及11.5%。不同于MTE-2 等的保護(hù)作用，MTE-18、20、21 共培養(yǎng)降低了細(xì)胞增殖能力，與LPS 組相比，細(xì)胞增殖能力分別降低9.5%，8.5%及8.3%。因此，選擇MTE-2 繼續(xù)進(jìn)行抗炎活性研究。

2.3 MTE對(duì)IEC-6細(xì)胞相關(guān)炎癥因子表達(dá)影響

MTE 對(duì) IEC-6 細(xì)胞分泌 NO、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10 的影響見(jiàn)表2。

表2 MTE 對(duì) IEC-6 細(xì)胞分泌 NO、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-10 的影響Table 2 Effects of MTE on NO，IL-6，IL-8，TNF-alpha and IL-10 secretion by IEC-6 cells

分析表2 試驗(yàn)結(jié)果可知，LPS 刺激使 NO、IL-6、IL-8、TNF-α 分泌顯著升高（p＜0.05），降低了 IL-10 的分泌。在 MTE、α-雪松醇處理后，TNF-α、NO 及 IL-6的分泌量顯著降低，而IL-10 分泌量則顯著增加，對(duì)IL-8 分泌量影響不明顯。不同于MTE、α-雪松醇，白酒及乙醇組未表現(xiàn)出對(duì)IEC-6 的保護(hù)作用，相關(guān)炎性因子TNF-α、NO 及IL-6 的分泌量不但沒(méi)有降低，相比于LPS 組，其分泌量反而增加。推測(cè)是乙醇具有一定的致炎作用導(dǎo)致的。但同樣是53%的酒精濃度，醬香型白酒對(duì)細(xì)胞的損傷弱于酒精，推測(cè)是白酒中的其它物質(zhì)減弱了乙醇對(duì)細(xì)胞的損傷作用。

2.4 MTE對(duì)IEC-6細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移能力的影響

MTE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移能力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 MTE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of MTE on LPS-induced IEC-6 cell apoptosis and cell migration

圖1-A 結(jié)果顯示，LPS 刺激IEC-6 細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯增加（正常組，p＜0.05）。MTE、α-雪松醇組IEC-6 細(xì)胞凋亡率明顯降低。與LPS 組比較，MTE、α-雪松醇處理后細(xì)胞凋亡率下降8.49%、13.2%。不同于MTE、α-雪松醇的保護(hù)作用，白酒組、乙醇組細(xì)胞凋亡率與正常組組比較，分別上升17.7%、22.4%。說(shuō)明白酒、乙醇加重了LPS 對(duì)細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞凋亡率上升。

同時(shí)試驗(yàn)采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)MTE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞遷移能力的影響，為便于比較，將正常組細(xì)胞遷移能力設(shè)為100%，其它組為相對(duì)值。結(jié)果如圖1-B 所示：與正常組比較，LPS 刺激ICE-6 細(xì)胞后，細(xì)胞遷移率顯著降低（與正常組比較，p＜0.05）。用MTE、α-雪松醇處理后，細(xì)胞遷移率顯著提高（與LPS組比較，p＜0.05），提示 MTE、α-雪松醇可增強(qiáng) IEC-6細(xì)胞抗LPS 損傷的能力。而白酒、乙醇組，細(xì)胞遷移能力與LPS 組相比，均有下降，推測(cè)可能是乙醇與LPS協(xié)同使IEC-6 細(xì)胞凋亡率上升、細(xì)胞遷移能力下降。

2.5 MTE對(duì)IEC-6細(xì)胞炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

MTE 對(duì)IEC-6 細(xì)胞炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 MTE 對(duì) LPS 處理 IEC-6 細(xì)胞 iNOS、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、Occludin 及 ZO-1 mRNA 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of MTE on the expression of iNOS，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-alpha，Occludin and ZO-1 in IEC-6 cells treated with LPS

如圖2 所示用LPS 刺激IEC-6 細(xì)胞后，與正常組相比，iNOS、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表達(dá)明顯上升（p＜0.05），而 IL-10 mRNA 表達(dá)下降。ZO-1、Occludin mRNA 表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組相比（p＜0.01）。MTE、α-雪松醇處理后，其mRNA 表達(dá)明顯提高（與LPS 比較，p＜0.05）。該試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，LPS 可導(dǎo)致 IEC-6 細(xì)胞相關(guān)炎性因子mRNA 的表達(dá)上升，Occludin 和ZO-1 mRNA 的表達(dá)下調(diào)，而MTE、α-雪松醇可抑制LPS 所致的ZO-1 mRNA 表達(dá)下調(diào)及炎性因子mRNA 的表達(dá)上升，使之恢復(fù)至接近正常水平。

3 結(jié)論

本研究采用LPS 刺激IEC-6 細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型探究醬香型白酒中非乙醇類(lèi)物質(zhì)抗炎活性。結(jié)果顯示，MTE-2（α-雪松醇）可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α 等炎性因子分泌，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，說(shuō)明MTE-2 可有效的抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞損傷修復(fù)能力。

LPS 刺激 IEC-6 細(xì)胞后，Occludin 和 ZO-1 的mRNA 表達(dá)量顯著下降，用MTE-2 干預(yù)后，Occludin和ZO-1 mRNA 表達(dá)得到明顯恢復(fù)，表明腸道炎癥與緊密連接蛋白存在密切的關(guān)系。結(jié)合前面所得的試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)MTE-2 通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞緊密連接蛋白的完整性和腸上皮屏障功能抑制LPS 所致的腸道損傷，而其中的作用機(jī)制可能與上調(diào)Occludin 和ZO-1 mRNA 與蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，醬香型白酒提取物表現(xiàn)出與其組分MTE-2 類(lèi)似的作用，而白酒及乙醇則與LPS 發(fā)揮協(xié)同作用，并對(duì)腸道細(xì)胞緊密連接完整性和腸上皮屏障功能具有一定的損傷作用。