李澤卿 劉彩賢 邢文 文亞峰

（中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，長沙 410004）

高溫是制約植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因素之一。近年來，隨著全球年平均最低溫度和最高溫度的持續(xù)上升，全球氣候變暖和“溫室效應(yīng)”現(xiàn)象日益明顯。氣候變暖不僅會影響植物的生長發(fā)育和植物的分布，還會嚴(yán)重降低很多經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，直接威脅種植業(yè)的發(fā)展［1］。因此，研究高溫影響植物生長發(fā)育的機(jī)制，提高植物抵抗高溫的能力對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

為了抵抗高溫脅迫的危害，植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，如熱激蛋白等分子伴侶的含量增加，能夠幫助維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的構(gòu)象，減少細(xì)胞的傷害［2］；或產(chǎn)生HSF、DREB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控［3］。此外，也有研究表明，為了適應(yīng)溫度的變化，植物進(jìn)化出了復(fù)雜的表觀遺傳機(jī)制以響應(yīng)環(huán)境溫度的脅迫［1］。microRNA（miRNA）調(diào)控基因的表達(dá)是植物表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中的一種重要調(diào)控方式。microRNA（miRNA）在真核生物基因組中普遍存在，其是一類由20-24個核苷酸組成的小的非編碼RNA，通常通過序列互補(bǔ)降解或抑制其靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，從而在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)［4］。大量研究表明，植物的miRNA在調(diào)控植物生長和發(fā)育，響應(yīng)逆境脅迫方面均起重要作用［5-9］。近年來，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫能夠影響植物miRNA的形成，大量響應(yīng)高溫脅迫的miRNA在植物中被鑒定出來，部分miRNA在高溫脅迫中的調(diào)控功能也得到證實［10-13］。

本文綜述了近年來在植物研究中發(fā)現(xiàn)的與高溫脅迫相關(guān)的miRNA，總結(jié)了miRNA在響應(yīng)高溫脅迫過程中的主要的調(diào)控機(jī)制，及其與其他調(diào)控因子和信號通路之間可能存在內(nèi)部聯(lián)系。為深入研究高溫脅迫相關(guān)miRNA的作用機(jī)制和調(diào)控通路，利用miRNA提高植物的抗熱性提供科學(xué)依據(jù)。

1 植物響應(yīng)高溫脅迫的分子機(jī)制

高溫是限制植物生長發(fā)育的重要脅迫因子。分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展為我們從分子水平認(rèn)知植物抵御高溫脅迫的機(jī)制提供了重要信息和研究手段。研究表明，植物在高溫脅迫下發(fā)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，以減少高溫脅迫對于機(jī)體的傷害。在分子水平上，植物響應(yīng)高溫脅迫的主要調(diào)控途徑有活性氧途徑（Reactive oxygen species，ROS）和激素調(diào)控途徑［14］、熱激轉(zhuǎn)錄因子-熱激蛋白（Heat stress transcription factor-heat shock protein、Ca離子-鈣調(diào)蛋白（Ca2+- CaM）途徑。熱信號傳遞在這3個途徑中都涵蓋3個步驟：先熱信號的感知、緊接著信號的傳遞和放大、再在分子水平上轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能基因的表達(dá)。通過MAPK途徑活性氧信號調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，下游的MBF1c、ZAT家族和WRKY轉(zhuǎn)錄因子等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能被MAPK的磷酸化激活［15］。這些轉(zhuǎn)錄因子再調(diào)控編碼具有抗氧化功能的抗氧化酶類［Ascorbate peroxidase（APX）、Catalase（CAT）等］和非酶類（還原型抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮等）基因的表達(dá)，從而提高植物的抗性［16］。而參與其中的高溫脅迫響應(yīng)基因可大致分為3類：第1類為轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因及參與信號級聯(lián)導(dǎo)系統(tǒng)，如轉(zhuǎn)錄因子（WRKY、HSF、ZAT、DREB等），以及蛋白激酶、泛素化酶和磷酸化酶等；第2類為直接對蛋白及生物膜起作用的功能蛋白，如在植物體內(nèi)分布最廣的是熱激蛋白HSPs（Heat shock proteins） 和 LEA（Late embryo-genesis abundant proteins）等（圖1）。在高溫脅迫下，植物體內(nèi)大部分mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的合成會受到抑制，而熱激蛋白常常作為 “分子伴侶”，參與植物受損蛋白的修復(fù)和維持植物細(xì)胞的存活［17-18］；第3類為水和離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白［14，19］。

近年來，大量研究表明，高溫脅迫除了導(dǎo)致植物編碼基因的表達(dá)發(fā)生改變之外，一些非編碼RNA的表達(dá)也發(fā)生了顯著改變，其中，miRNA作為重要的非編碼RNA調(diào)控手段，參與了編碼分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子等靶標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控，影響了植物的抗熱性［20-21］。

2 miRNA的形成過程、作用機(jī)制及生物學(xué)功能

miRNA需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、加工和復(fù)合體裝配3個過程才能最終形成。植物中非編碼的MIR基因，能夠在細(xì)胞核中由轉(zhuǎn)錄聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄出初級miRNA轉(zhuǎn)錄本（Primary miRNA transcripts），它是一段能形成不完美莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。初級miRNA轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過3個步驟加工成為具有轉(zhuǎn)錄功能的成熟miRNA：（1）首先在鋅指蛋白SE、核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）DCL1，以及輔酶因子HYL1的共同作用下被加工成 miRNA 的 前 體（Precursor of miRNAs）；（2） 在SE、DCL1及HYL1共同作用下被加工成miRNA和miRNA* 的二聚體結(jié)構(gòu)（miRNA/miRNA*duplex）［22］；（3）其中被甲基化的一條miRNA*的二聚體會被導(dǎo)出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后與Agonaute蛋白（AGO）結(jié)合裝配成RISC，這時的sRNA具有了轉(zhuǎn)錄后沉默功能，是成熟的miRNA。而一般核酸酶會降解另一條被稱為miRNA*的二聚體。有研究者發(fā)現(xiàn)，其中一條在二聚體的5'端并配對不緊密的miRNA與AGO蛋白結(jié)合并行使功能［23］。

圖1 高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（改自O(shè)hama 等［3］）

miRNA通過堿基互補(bǔ)配對原則識別靶基因［5］。根據(jù)其與靶基因的互補(bǔ)程度不同，miRNA通過對靶mRNA切割和翻譯抑制2種轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，指導(dǎo)RISC下調(diào)基因表達(dá)：在靶基因和miRNA匹配性廣泛或者匹配度較高的時候，mRNA會被RISC剪切；而當(dāng)靶基因和miRNA的匹配度較低且低到不能夠讓RISC剪切靶基因的時候，靶基因會被RISC通過翻譯抑制而沉默［23］。因為植物miRNA和靶基因的匹配屬于廣泛性匹配，所以miRNA主要是通過RISC選擇剪切mRNA來抑制靶基因的表達(dá)［24］。不過還是有一小部分植物的靶基因和miRNA的匹配度較低，則miRNA調(diào)控RISC通過翻譯抑制來沉默靶基因［25-26］。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的miRNA從植物中被鑒定。在最新的第22版本miRBase里，一共有326個編碼miRNA的位點存在于擬南芥基因組，有588個編碼miRNA的位點存在于水稻基因組，有697個編碼miRNA的位點存在于楊樹基因組（http：//www.mirbase.org/）。隨著對miRNA研究得不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)miRNA在植物的生長和發(fā)育中均起著調(diào)控作用［5-6］，其作為調(diào)控因子，廣泛地參與到植物生長發(fā)育的不同階段（表1）。此外，miRNA也參與到了植物響應(yīng)生物及非生物逆境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。近年來，越來越多參與響應(yīng)各種生物及非生物逆境的miRNA在模式植物被鑒定出來（表1）。已有大量研究表明，miRNA在植物響應(yīng)高溫脅迫中也充當(dāng)重要角色［21，27-44］。

3 miRNA在植物響應(yīng)高溫脅迫中的研究

3.1 miRNA在植物響應(yīng)高溫脅迫中的表達(dá)

近年來，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展與成熟，通過small RNA深度測序，從不同植物中鑒定出大量響應(yīng)高溫脅迫的保守或者非保守 miRNA［12-13，45］。研究表明，在高溫脅迫下，植物miRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出或上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)方式，在部分植物中上調(diào)與下調(diào)的miRNA的數(shù)量差異并不顯著：在水稻中鑒定出47個響應(yīng)高溫脅迫的miRNA，其中26個miRNA表達(dá)下調(diào)，21個miRNA表達(dá)上調(diào)［11］；在番茄中，處于適當(dāng)升溫的環(huán)境下，分別有39/38個已知的miRNA出現(xiàn)了顯著性的上調(diào)/下調(diào)，而在劇烈的升溫下，則分別有62/57個已知的miRNA出現(xiàn)了顯著性的上調(diào)/下調(diào)［58］。而部分植物中則大部分表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)：在蘿卜中，26個已知的和19個新的miRNA在高溫脅迫下出現(xiàn)了顯著性差異表達(dá)，且大部分表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，只有少數(shù)上調(diào)表達(dá)［59］。在中國白楊中，15個高溫響應(yīng)的miRNA家族被鑒定出來，且大部分miRNA的表達(dá)量下調(diào)［27］。

在不同植物中響應(yīng)高溫脅迫的miRNA不盡相同，目前，已發(fā)現(xiàn)在大部分植物中均響應(yīng)高溫脅 迫 的 miRNA 包 括 miR472、miR408、miR398、miR395、miR171、miR169、miR168、miR167、miR166、miR160、miR159 和 miR156 等［28-29］。 相同的miRNA在不同植物響應(yīng)高溫脅迫下的的表達(dá)模式也不完全相同（表2）。miR159在木薯和水稻中在受高溫脅迫后下調(diào)表達(dá)［11，30］；而在擬南芥、小麥和大白菜中則表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)［33，35，41］。miR160 則在木薯和小麥中下調(diào)表達(dá)，而在水稻、擬南芥和棉花中上調(diào)表達(dá)［11，21，28，48，60］。在高溫脅迫下，miR398則在水稻、小麥和擬南芥中上調(diào)表達(dá)，而在大白菜中下調(diào)表達(dá)［33，35，41］。

還有研究發(fā)現(xiàn)，同一家族的miRNA在不同植物中對高溫脅迫的響應(yīng)模式也不同。在小麥、擬南芥和大白菜中，高溫脅迫下，miR156家族的miR156a、miR156h和miR156g上調(diào)表達(dá)；而在樺木、木薯和水稻中，miR156a和miR156d則受高溫抑制表達(dá)［11，30，32-33，35，61］。

表1 miRNA的生物學(xué)功能

3.2 miRNA在植物高溫脅迫響應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制

miRNA主要是通過抑制靶基因的表達(dá)參與到植物的各種代謝和信號途徑當(dāng)中。隨著研究得不斷深入，明確了部分miRNA的靶向基因，并對其在高溫脅迫下的作用機(jī)制有了一定的了解。同一miRNA可能存在多個靶向基因，且不同植物受到高溫脅迫時，作用的靶向基因不完全一致。轉(zhuǎn)錄因子是miRNA作用的重要靶向基因之一。目前發(fā)現(xiàn)的植物在高溫脅迫下受到miRNA調(diào)控較多的有ARF、MYB、WRKY和SPL等家族的轉(zhuǎn)錄因子（表2）。miR160的靶向基因為ARF類轉(zhuǎn)錄因子：miR160在擬南芥中抑制其靶基因ARF17，ARF16和ARF10的表達(dá)，并通過調(diào)控HSP基因的表達(dá)從而提高擬南芥的抗熱性［21］；而在玉米中，miR160參與生長素信號途徑，通過抑制其靶基因ARF17和ARF10的表達(dá)，從而導(dǎo)致高溫脅迫下玉米雄性不育［62］。miR156在擬南芥中作用的靶向轉(zhuǎn)錄因子為SPL家族轉(zhuǎn)錄因子，miR156通過抑制SPL的表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對高溫的記憶從而調(diào)節(jié)抗熱性［33］。而在小麥中，高溫脅迫下miR156的靶向基因為TaGAMYB1和TaGAMYB2［63］。此外，在耐熱性較好的向日葵中還發(fā)現(xiàn)miR396通過調(diào)控WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子HaWRKY6的表達(dá)，從而幫助向日葵不受到高溫脅迫的傷害［60］。除了轉(zhuǎn)錄因子以外，在小麥中還發(fā)現(xiàn)了miR156、miR159、miR160、miR167、miR319、miR395和miR398等眾多miRNA家族參與了HSP17、HSP70和superoxide dismutase等高溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控［35］。

表2 植物中響應(yīng)高溫脅迫的miRNA

大量研究還表明，miRNA通過調(diào)控激素響應(yīng)途徑參與到植物響應(yīng)高溫脅迫。miR160、miR167、miR390和miR393在高溫脅迫下均參與到了生長素代謝途徑中［35-37］。miR159在高溫脅迫下能夠調(diào)控GA3代謝途徑［35，38］。而 miR319 在高溫脅迫下則參與調(diào)控茉莉酸代謝途徑［35，39］。

在這些響應(yīng)高溫脅迫的miRNA中，miR398和miR156在植物響應(yīng)高溫脅迫中的調(diào)控途徑研究較為深入。在擬南芥中miR398的靶標(biāo)為控制ROS的產(chǎn)生的COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE 1（CSD1）、CSD2和 COPPER CHAPERONE FOR SOD 1（CCS）基因［40］。miR398超量表達(dá)抑制了這些活性氧清除酶的表達(dá)，導(dǎo)致ROS的積累，改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，從而誘導(dǎo)HSPs及HSFs的表達(dá)，最終提高了擬南芥對高溫的抗性。還發(fā)現(xiàn)HSFA7b和HSFA1b能結(jié)合在miR398的啟動子區(qū)域，從而參與miR398的熱誘導(dǎo)過程［40］。因此在擬南芥中，miR398與其靶標(biāo)CSD1、CCS以及CSD2，HSFs共同組成了一條耐熱回路（圖3）。除了擬南芥以外，在大白菜和毛白楊中同樣也發(fā)現(xiàn)了類似的耐熱回路［28，41］。與miR398不同，在擬南芥中，miR156的靶向基因為SQUAMOSAPROMOTER BINDING-LIKE（SPL）transcription factors。該家族轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)熱擊響應(yīng)基因HsfA2和HSPs的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)，從而提高植物的抗熱性（圖3）。研究還發(fā)現(xiàn)miR156在高溫脅迫下特異表達(dá)。因此，miR156和SPLs組成的調(diào)控模塊被認(rèn)為是植物形成高溫脅迫記憶的關(guān)鍵元件，對植物的獲得性抗熱有促進(jìn)作用［33］。

圖3 擬南芥中miR398和miR156與其靶基因參與的耐熱性調(diào)控途徑

4 結(jié)語

植物逆境脅迫廣泛存在于植物的生長發(fā)育過程中，而隨著溫室效應(yīng)的愈加嚴(yán)重，高溫脅迫對植物的生長和發(fā)育影響愈加深遠(yuǎn)。近年來，對植物中響應(yīng)高溫脅迫的miRNAs研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展：隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，諸多miRNA及其靶基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定；已有研究明確了miRNA作為重要的非編碼RNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控廣泛參與植物高溫脅迫響應(yīng)，其調(diào)控的靶基因大多編碼轉(zhuǎn)錄因子或酶類。然而，目前，miRNA參與植物的高溫脅迫的報道主要集中于模式植物中，對在其他觀賞植物和經(jīng)濟(jì)植物中的研究報道較少。且大多miRNAs及其靶基因的功能僅停留在生物信息學(xué)預(yù)測與分析上，并沒有得到試驗證明。miRNA及其靶基因是如何參與到植物響應(yīng)高溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑還有待進(jìn)一步研究。但不可否認(rèn)的是，以miRNA差異表達(dá)以及對靶基因的調(diào)控角度探究植物在高溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制為植物抗高溫脅迫提供了新的研究思路，對挖掘植物抗高溫機(jī)制以及培育抗高溫新材料具有十分重要的意義。在后續(xù)的研究中，miRNA及其靶基因在高溫脅迫中的功能驗證及其參與植物響應(yīng)高溫脅迫分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制將成為植物抗高溫育種的研究重點。