陳婷　王娟英　吳林坤　陳軍　吳紅淼　林生　林文雄

摘要：【目的】針對(duì)藥用植物懷牛膝耐連作甚至表現(xiàn)連作促進(jìn)的特殊現(xiàn)象，分析不同連作年限懷牛膝根際土壤關(guān)鍵微生物群落結(jié)構(gòu)變化，探討不同連作年限懷牛膝根際微生物組的演變過(guò)程，為破解大多數(shù)藥用植物連作障礙提供理論借鑒。【方法】本研究以連作1年、10年、15年懷牛膝根際土壤與撂荒田對(duì)照土壤為試驗(yàn)材料，采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)分析芽孢桿菌屬和鐮刀菌屬群落結(jié)構(gòu)差異。【結(jié)果】在懷牛膝根際土壤中，芽孢桿菌屬種類豐富，其中優(yōu)勢(shì)菌群為枯草芽孢桿菌（Bacillus stubtilis）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）;且與1年土壤相比，連作10年和15年的土壤中會(huì)明顯增加枯草芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌的相對(duì)含量。鐮刀菌屬的條帶數(shù)日相對(duì)較少，種類多樣性少，在群落結(jié)構(gòu)上CK和15Y比較相似，1年和10年相似，優(yōu)勢(shì)菌群為腐皮鐮刀菌（Fusariumsolani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。qPCR定量分析顯示，懷牛膝連作下會(huì)增加其有益細(xì)菌的含量，而有害菌鐮刀菌屬基本維持在一個(gè)水平?！窘Y(jié)論】多年連作懷牛膝能夠增加根際有益微生物群落的多樣性與種群豐度，抑制病原微生物群落的多樣性與種群豐度，通過(guò)選擇性促抑影響根際微生物組成而自我塑造健康的根際微生態(tài)環(huán)境。

關(guān)鍵詞：懷牛膝;連作;芽孢桿菌;鐮刀菌;DGGE

中圖分類號(hào)：S 567

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1234-10

0引言

【研究意義】據(jù)統(tǒng)計(jì)，70%塊根類藥材都存在非常嚴(yán)重的連作障礙現(xiàn)象（如地黃、太子參、人參、三七等）[1-3]。然而，同樣是常用大宗中藥材，懷牛膝（Achvranthes bidentata Blume）與大多數(shù)忌連作的藥用植物不同。它是一種耐連作的中藥植物[4-6]。其以地下部塊根入藥，因主產(chǎn)于古懷慶府（今焦作市）狀似牛的膝蓋而得名，以河南省溫縣和焦作栽培歷史最為悠久，品質(zhì)優(yōu)，產(chǎn)量高。在河南省生態(tài)觀察站長(zhǎng)期定點(diǎn)觀察發(fā)現(xiàn)，在連作田塊上種植懷牛膝產(chǎn)量比頭茬種植的懷牛膝產(chǎn)量增產(chǎn)1.66倍[7]。而種植于臨近地塊的地黃卻表現(xiàn)嚴(yán)重的連作障礙現(xiàn)象，出現(xiàn)隨種植年限的延長(zhǎng)其產(chǎn)量與質(zhì)量顯著降低趨勢(shì)[1]。本課題組研究認(rèn)為造成兩種藥用植物對(duì)連作響應(yīng)如此不同的原因，主要與連作導(dǎo)致的根際微生物組成發(fā)生不同演變有關(guān)[8]。故此，分析不同連作年限懷牛膝根際土壤關(guān)鍵微生物群落結(jié)構(gòu)變化，探討不同連作年限懷牛膝根際微生物組的演變過(guò)程，不僅對(duì)于豐富作物根際生態(tài)學(xué)內(nèi)容有重要意義，而且對(duì)于進(jìn)一步探索利用良好根際微生物組形成條件與調(diào)控策略，破解絕大多數(shù)藥用植物單一化栽培所帶來(lái)的連作障礙難題也具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著對(duì)土壤環(huán)境的深入了解，越來(lái)越多的學(xué)者意識(shí)到根際土壤微生物區(qū)系的變化對(duì)作物健康起著關(guān)鍵作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物的活性、數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu)的變化，直接影響著植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收，也影響著植物對(duì)惡劣環(huán)境的抵抗能力[10]。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，直接參與了土壤中許多的生理生化反應(yīng)，土壤微生物的活性是否能夠促進(jìn)物質(zhì)能量的良好循環(huán)是土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要標(biāo)志[11-12]。研究表明，藥用植物的連作障礙現(xiàn)象表現(xiàn)為連作后，其根際的土壤環(huán)境發(fā)生巨大改變，根際土壤微生物的真菌型群落占據(jù)了主導(dǎo)地位，抑制了細(xì)菌型群落的發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)菌總量降低，多樣性指數(shù)顯著減少[10，l13-14]。吳林坤[15]通過(guò)對(duì)地黃研究發(fā)現(xiàn)，連作下的細(xì)菌（如假單胞菌和芽孢桿菌屬）的含量都會(huì)隨連作年限的增加而顯著下降，但真菌群落（如尖孢鐮刀菌和鐮刀菌屬）的變化卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)?？梢?jiàn)，這種微生物區(qū)系的變化，包括有益菌減少而病原菌增加，正是導(dǎo)致地黃連作障礙形成的重要因素。然而，課題組前期對(duì)不同連作懷牛膝根際土壤微生物分析發(fā)現(xiàn)有益菌（如假單胞菌和芽孢桿菌屬）含量隨連作年限的增加而增加，這是懷牛膝耐連作的生物學(xué)基礎(chǔ)[4-7]。芽孢桿菌屬是土壤中最主要的細(xì)菌屬之一，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮多種生態(tài)功能。據(jù)報(bào)道，該屬大部分物種都是有益菌，可通過(guò)獲取養(yǎng)分、產(chǎn)生植物激素、保護(hù)植物免受病原體和其他非生物脅迫的作用從而直接或間接地促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在許多不同的農(nóng)田和園藝作物中（如黃瓜、水稻、玉米、油菜等）都報(bào)道了將芽孢桿菌用作植物促生菌（PGPR）來(lái)防治作物病蟲害，且表現(xiàn)出良好的防治效果[16]。而鐮刀菌屬（Fusarium）是一類包含許多能產(chǎn)生類固醇大分生孢子的真菌，廣泛分布在土壤和有機(jī)基質(zhì)中。鐮刀菌長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是重要的植物病原菌，因?yàn)樗哂泻軓?qiáng)的攻擊宿主植物的能力，造成植物枯萎病和莖桿腐爛等[17-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】芽孢桿菌屬與鐮刀菌屬這兩種重要的微生物在連作懷牛膝根際是如何演變的，尚不清楚。因此，為了在生物控制中更好地了解和應(yīng)用微生物群落的多樣性潛力，需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明這兩種潛在重要微生物的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用DGGE技術(shù)分析不同連作年限懷牛膝根際芽孢桿菌屬以及鐮刀菌屬的群落變化，以期揭示不同連作年限下懷牛膝根際土壤中兩種微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化情況，為后續(xù)探索懷牛膝耐連作潛在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究試驗(yàn)地位于河南省武陟縣駕部村（34°59′49″N，113°15′56″E），該區(qū)域土壤為堿性砂壤土。試驗(yàn)以廣泛種植懷牛膝品種核桃紋為供試品種，于6月份在不同連作年限的懷牛膝大田土壤中種植，采用土壤深耕整地后撒播，播種用種量為9～10kg·hm-2，將種子拌入適量細(xì)土均勻?yàn)⒉?。出苗后待苗?cm左右后間苗，保持苗間距規(guī)格為20cm×15cm，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程的田間管理如水分管理、藥肥施用等措施相同。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，即撂荒田（空白對(duì)照，CK）、連作1年（1Y）、連作10年（10Y）和連作15年（15Y）的懷牛膝大田土壤。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)面積25m2。在10月份懷牛膝地下部膨大期，在每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)中按照5點(diǎn)取樣法采集懷牛膝根際土壤，并用0.2mm的篩子篩出土壤中的植物根等雜質(zhì)，過(guò)篩的土壤置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2土壤總DNA的提取

使用BioFlux公司（杭州，中國(guó)）的BioFast soilGenomic DNA Extraction Kit提取試劑盒提取土壤總DNA。提取步驟按照說(shuō)明書上操作。將提取的土壤總DNA經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3芽孢桿菌屬和鐮刀菌屬的巢氏PCR擴(kuò)增

巢氏PCR采用提取的土壤總DNA樣品為模版，50μL反應(yīng)體系：2×PCR預(yù)混溶液25μL，上下游引物各1μL，DNA模版1μL，ddH2O22μL。擴(kuò)增引物及程序見(jiàn)表1。芽孢桿菌屬采用引物對(duì)R1378和Bacf先進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后將第一輪產(chǎn)物稀釋20倍作為DNA模版，用引物對(duì)F968-GC和R1378進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。鐮刀菌屬采用引物對(duì)EF-1和EF-2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，將第一輪PCR產(chǎn)物作為模版，用引物對(duì)Alfie-GC和Alfie-2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。最終獲得的PCR產(chǎn)物采用Gel ExtractionKit膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收后備用。

1.4芽孢桿菌屬和鐮刀菌屬的DGGE過(guò)程

清洗整個(gè)DGGE自動(dòng)灌膠系統(tǒng)，制備變性梯度為45%～55%（芽孢桿菌屬）或35%～45%（鐮刀菌屬）的變性膠，預(yù)熱DGGE電泳槽中的1×TAE溶液至60℃后，將制好的凝膠放入到電泳槽預(yù)電泳15min后上樣。在80V、60℃條件下電泳16h（芽孢桿菌屬）或12.5h（鐮刀菌屬）。

電泳完成后對(duì)變性膠進(jìn)行銀染，方法如下：將膠放入固定液（含有0.5%冰醋酸，10%乙醇），50r·min-1振蕩15min;倒掉固定液，用雙蒸水清洗兩次，每次2min;再將變性膠放入染色液（含有0.2%AgNO3，0.1%甲醛），50r·min-1避光銀染20min;倒掉染色液，用雙蒸水清洗兩次，每次1min;加入顯影液（含有1.5%NaOH，0.1%甲醛），50r·min-1震蕩至出現(xiàn)明顯條帶;倒掉顯影液，用雙蒸水清洗2遍后將變性膠置于凝膠成像儀上拍照。

1.5梯度變性膠的條帶回收及鑒定

將目的條帶切下并放入1.5mL離心管中，用150μL無(wú)菌水洗滌3次，加入40μL無(wú)菌水于4℃下浸泡過(guò)夜，10000g離心10min。取上清液作為模版，以兩種菌第二輪PCR的引物進(jìn)行PCR，體系和程序步驟均同上。將回收產(chǎn)物用TransGene Biotech公司的pEASY-T1Simple Cloning Vector和TransGene Biotech公司的Trans-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆。克隆產(chǎn)物送至測(cè)序公司（福州伯尚）測(cè)序，所得序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6土壤中芽孢桿菌屬及尖孢鐮刀菌的實(shí)時(shí)熒光定量

qPCR采用土壤總DNA作為模板，R1378/Bacf（芽孢桿菌屬）和ITS1F/AFP308（尖孢鐮刀菌）為引物（表1）。反應(yīng)總體積為15μL，其中2×Taqmixture7.5μL，上下游引物各0.6μL，ddH2O5.3μL，DNA模版1.0μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用已知種/屬的陽(yáng)性克隆子擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用Nanodrop檢測(cè)其濃度和純度后，將質(zhì)粒稀釋成（1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005）8個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，計(jì)算芽孢桿菌屬及尖孢鐮刀菌的基因拷貝數(shù)。

1.7數(shù)據(jù)分析

使用BIORAD公司的Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化分析。使用SPSS Statistics 22.0對(duì)Quantity One軟件處理得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。多樣性分析以及顯著性分析等使用DPS 7.05軟件進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1根際土壤微生物總DNA的提取及PCR擴(kuò)增

由圖1可知，土壤總DNA提取試劑盒（BioFastSoil Genomic DNA Extraction Kit，杭州，中國(guó)）適合懷牛膝根際土壤總DNA的提取，提取的DNA條帶清晰（圖1-A），無(wú)降解，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。采用巢式PCR能夠穩(wěn)定擴(kuò)增出約410bp的芽孢桿菌屬特異片段（圖1-B）和約500 bp的鐮刀菌屬特異片段（圖1-C）。

2.2懷牛膝根際土壤芽孢桿菌屬多樣性分析

2.2.1懷牛膝根際土壤茅孢桿菌屬DGGE條帶分析

圖2為不同連作年限下的懷牛膝根際土壤芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)的變化。每個(gè)泳道中不同的條帶代表不同的芽孢桿菌基因片段，條帶的亮度反映出菌群的相對(duì)含量。從圖中結(jié)果可以看出：不同連作土壤間芽孢桿菌條帶存在差異，但同一年的樣品3個(gè)重復(fù)之間相似度很好。圖譜的條帶位置信息利用Quantity One軟件轉(zhuǎn)化成了數(shù)字化的信息，以便后續(xù)分析。

2.2.2芽孢桿菌屬的主成分分析 利用Quantity one軟件分析得到的灰度值，在SPSS軟件上對(duì)4種不同年限的土壤芽孢桿菌DGGE結(jié)果進(jìn)行主成分分析（圖3）。主成分1和主成分2的累計(jì)貢獻(xiàn)值達(dá)到86.17%，具有較好的代表性。如圖3所示，CK位于主成分1軸負(fù)端，1Y位于主成分2軸正端，10Y位于主成分1軸和2軸交叉處，15Y位于主成分2軸負(fù)端，可見(jiàn)主成分1和主成分2能基本區(qū)分不同連作年限的懷牛膝根際土壤芽孢桿菌菌落特征。

2.2.3芽孢桿菌屬的多樣性分析 懷牛膝根際土壤芽孢桿菌群落的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)和Brillouin指數(shù)的分析結(jié)果表明（表2），隨著連作年限的增加，土壤芽孢桿菌的Simpson指數(shù)和均勻度相對(duì)穩(wěn)定，Shannon和Brillouin指數(shù)增加。

2.2.4芽孢桿菌屬的條帶序列分析 芽孢桿菌屬的DGGE膠共挖取37個(gè)條帶進(jìn)行鑒定，全部條帶鑒定成功。4種土壤樣品都分離出了不同強(qiáng)度和數(shù)量的條帶，說(shuō)明每種樣品具有較豐富的芽孢桿菌種群多樣性。通過(guò)Blast網(wǎng)站序列比對(duì)進(jìn)行定性分析（表3），選擇同源性為100%的微生物種屬，這些種類主要包括11類：枯草芽孢桿菌（Bacillus stubtilis）（條帶3、4、20、21、26、27），蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）（條帶7、8、22、24、25），解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（條帶13、16、29），耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans）（條帶32、33），蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mvcoides）（條帶2、5），奧德賽芽孢桿菌（Bacillus odvssevi）（條帶23），短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）（條帶18、19、28），芽孢桿菌（Bacillus sp.）（條帶1、11、14、30、31、35、37），另外有4條經(jīng)鑒定為其他類別菌（短狀桿菌Brachvbacterium sp.（條帶6）和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌.Stenotrophomonas maltophilia（條帶1 2、1 7、34））和4個(gè)不可培養(yǎng)的未知菌種（Uncultured bacterium條帶9、10、15、36）。樣品CK中最亮的條帶是7、8和9，表明優(yōu)勢(shì)菌群為蠟樣芽孢桿菌和不可培養(yǎng)菌。1Y樣品中最亮的條帶是3、5和7，表明優(yōu)勢(shì)菌群為枯草芽孢桿菌、蕈狀芽胞桿菌和蠟樣芽孢桿菌。樣品IOY和15Y中最亮的條帶是20、21、22和8，表明優(yōu)勢(shì)菌群為枯草芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。與1Y相比，10Y中多出的條帶20、21、27都為枯草芽孢桿菌，而15Y中多出的條帶為20、21、32、33，其中條帶32、33為耐鹽芽孢桿菌。

2.3懷牛膝根際土壤鐮刀菌屬多樣性分析

2.3.1懷牛膝根際土壤鐮刀菌屬DGGE條帶分析圖4是懷牛膝根際土壤鐮刀菌屬的DGGE圖譜。從中可知，4種不同連作年限懷牛膝土壤中，CK和15Y條帶分布比較相似，1Y和10Y條帶分布相似，條帶的數(shù)目沒(méi)有明顯增加的趨勢(shì)。

2.3.2鐮刀菌屬的主成分分析 對(duì)4種土壤鐮刀菌屬進(jìn)行主成分分析（圖5）。主成分1解釋48.5%的變量方差和主成分2解釋29.31%的變量方差，累積貢獻(xiàn)為77.81%。觀察圖5可知，4個(gè)樣品位于坐標(biāo)軸的4個(gè)象限，在主成分1上CK和15Y比較相似，1Y和10Y相似，主要在主成分2上樣品間有差異。

2.3.3鐮刀菌屬的多樣性分析 鐮刀菌屬群落的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)以及Brillouin指數(shù)的分析結(jié)果顯示（表4），各指數(shù)均出隨著連作年限的增加略有增加的變化趨勢(shì)。

2.3.4鐮刀菌屬的條帶序列分析 將4種樣品中的條帶（F1～15）對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接T-載體后雙向測(cè)序并拼接，將所得結(jié)果在NCBI中進(jìn)行相似性比對(duì)，選擇同源性為100%的微生物種屬，結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)鑒定結(jié)果可知，鐮刀菌種類主要包括以下4類：尖孢鐮刀菌（Fusarium oxvsporum）（條帶2、6、8、12），腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）（條帶1、3、4、9、10、11、13），木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）（條帶5）和鐮刀菌（Fusarium sp）（條帶7、14），其中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）是懷牛膝根際土壤中鐮刀菌屬的優(yōu)勢(shì)菌群。由DGGE圖譜可知，不同連作下懷牛膝根際樣品中最亮的條帶是11、12和13，表明優(yōu)勢(shì)菌群為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.4芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌的qPCR絕對(duì)定量分析

試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵微生物菌群芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌的含量進(jìn)行qPCR絕對(duì)定量分析?；趒PCR定量的特異引物，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量結(jié)果如圖6所示：在連作1～10年，芽孢桿菌的含量無(wú)顯著差異，連作15年表現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。而尖孢鐮刀菌的數(shù)量則穩(wěn)定在一個(gè)水平。

3討論

根際環(huán)境是指植物根系活動(dòng)所依賴的土壤微域環(huán)境，它是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的微型生態(tài)系統(tǒng)，在植物生長(zhǎng)、吸收、分泌過(guò)程中扮演著重要角色。而在這片區(qū)域活動(dòng)的最為活躍的根際土壤微生物也被稱為植物的第二基因組，近年來(lái)已成為學(xué)者們的研究焦點(diǎn)[8，24]。植物根際微生物包括固氮菌，根際促生菌和真菌在內(nèi)的微生物群落組成和豐度的變化可以顯著影響根際土壤的活性與物質(zhì)能量的循環(huán)過(guò)程，從而影響植株生長(zhǎng)。Wu等[1]發(fā)現(xiàn)，連作下地黃產(chǎn)量與品質(zhì)明顯下降，是因?yàn)殡S著連作年限的增加，根際中對(duì)致病性尖孢鐮刀菌具有拮抗活性的有益菌（如假單胞菌，芽孢桿菌）種群顯著減少。華菊玲等[25]發(fā)現(xiàn)，連作下芝麻根際微生物區(qū)系失衡，土壤有益菌（芽孢桿菌Bacillus）的菌群數(shù)量明顯下降，而病原菌青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）的含量顯著上升，導(dǎo)致了芝麻的連作障礙產(chǎn)生。連作障礙作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重大問(wèn)題，嚴(yán)重制約了我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[26]。這種連作效應(yīng)的產(chǎn)生與其根際微生物的多樣性密不可分，而作為常見(jiàn)的一類PGPR——芽孢桿菌在土壤微生態(tài)環(huán)境中也扮演著重要角色。據(jù)報(bào)道，大部分芽孢桿菌定植于植物根際后，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，能與植物逐漸形成復(fù)雜的互作關(guān)系，包括提供植物生長(zhǎng)過(guò)程中所需的營(yíng)養(yǎng)元素，合成一些次生代謝物質(zhì)，如激素和抗生素等，直接或間接調(diào)節(jié)植物相關(guān)基因表達(dá)和根際土壤中其他生物群落結(jié)構(gòu)等，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[15]。喬俊卿等[27]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bs916能促進(jìn)番茄植株鮮重的顯著增加，在播種15d后，試驗(yàn)組番茄的鮮重達(dá)79.8mg，比對(duì)照組增長(zhǎng)9.61%。本研究定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懷牛膝根際芽孢桿菌的數(shù)量并沒(méi)有呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，結(jié)合DGGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，其群落結(jié)構(gòu)隨著連作年限的增加而朝著多樣化、數(shù)量增多的趨勢(shì)變化。試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)懷牛膝連作下會(huì)增加枯草芽孢桿菌和耐鹽芽孢桿菌的含量，說(shuō)明了懷牛膝耐連作的關(guān)鍵原因之一可能就是由于根際土壤中有益菌數(shù)量隨著連作年限的增加而增加。

許多學(xué)者的研究都表明，鐮刀菌屬是最重要的植物病原菌類之一，在全球范圍內(nèi)在諸多作物上都有報(bào)道，它能夠顯著抑制植物的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致多種病癥，如西瓜枯萎病、大豆根腐病、小麥赤霉病等[28-30]。此外，研究表明，土壤中的鐮刀屬在侵染的過(guò)程中能夠分泌次生代謝物-毒素，這種物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致植物生理失調(diào)、細(xì)胞死亡等癥狀[31]。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)造成小麥赤霉病的病原菌禾谷鐮刀菌就能產(chǎn)生多種毒素，包括單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone））、伏馬毒素（（FumonisinFB），這些毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，受熱不分解，不僅造成小麥產(chǎn)量損失，毒素污染更是造成食品安全的重大隱患。對(duì)于鐮刀菌屬的研究，多采用平板分離法和形態(tài)學(xué)鑒定等方法[33]。然而由于土壤中的真菌許多不能通過(guò)室內(nèi)平板培養(yǎng)法培養(yǎng)，從而造成了對(duì)鐮刀菌等真菌群落在土壤中的分布描述不準(zhǔn)確。變性梯度凝膠電泳（DGGE）通過(guò)利用分子標(biāo)記的方法避開(kāi)了平板培養(yǎng)法的缺點(diǎn)，更好地了解土壤中鐮刀菌屬等真菌群落結(jié)構(gòu)的變化[22]。Chen等[34]利用DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)太子參的連作下會(huì)使得鐮刀菌種類，特別是尖孢鐮刀菌含量的顯著增加。于妍華[35]在對(duì)西洋參的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)usarium solani和Fusarium oxvsporum在重茬土壤中為主要優(yōu)勢(shì)真菌，并且Fusarium solani對(duì)西洋參有較強(qiáng)的侵染作用。與連作障礙不同的是，本研究中發(fā)現(xiàn)，懷牛膝連作下并不會(huì)導(dǎo)致病原菌鐮刀菌的含量增加，連作1～15年的根際土壤鐮刀菌的含量沒(méi)有顯著差異。表明懷牛膝連作下土壤并沒(méi)有惡化，鐮刀菌屬群落結(jié)構(gòu)也維持著一定的水平，其菌群群體數(shù)量沒(méi)有出現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)。

綜上可知，懷牛膝連作下其根際微生物群落結(jié)構(gòu)向著自身良性方向發(fā)展，表現(xiàn)為根際促生菌聚集生長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)不同連作年限根際土壤的病原菌鐮刀菌屬種群數(shù)量維持在穩(wěn)定的水平，這是懷牛膝耐連作的生物學(xué)基礎(chǔ)。這一結(jié)果不僅對(duì)于豐富作物根際生態(tài)學(xué)內(nèi)容有重要意義，而且對(duì)于進(jìn)一步減緩其他作物連作障礙現(xiàn)象有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：張梅）

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收稿日期：2020-07-28初稿：2020-09-27修改稿

作者簡(jiǎn)介：陳婷（1981-），女，博士，助理研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)（E-mail： iamchenting@126.com）

*通信作者：林文雄（1957-），男，博士，教授，研究方向：農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)（E-mail： wenxiong181@163.com）

基金項(xiàng)目：福建省教育廳中青年教師科研項(xiàng)目（JATl70200）;閩臺(tái)作物特色種質(zhì)創(chuàng)制與綠色栽培協(xié)同創(chuàng)新中心（2015-75）