張穎　張凱　馬金成　李小杰　馬春驥　高力揚(yáng)

摘要：【目的】評(píng)估小鼠巨噬細(xì)胞系Raw 264.7替代綿羊肺泡巨噬細(xì)胞用于研究綿羊肺炎支原體（MycoplasmaovipneumonZae，Mo）致病機(jī)制的可行性?！痉椒ā繌木d羊肺臟灌洗液中分離綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞，以綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞系為細(xì)胞模型，使用綿羊肺炎支原體Y98標(biāo)準(zhǔn)株分別感染（MOI=10）綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞系24h后，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)或定時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Mo刺激后兩種細(xì)胞中部分蛋白或基因的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】從肺中成功分離出綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光鑒定顯示其帶有巨噬細(xì)胞特異性表面抗原CD14;經(jīng)Mo感染后，綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7中FADD、IL-1β、NOS2及THBS1等基兇的表達(dá)均發(fā)生顯著變化，主要涉及Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、白噬作用等生物過(guò)程且兩種細(xì)胞各基兇的相對(duì)表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致?！窘Y(jié)論】本研究初步表明選用小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞系替代綿羊原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行與Mo的互作研究具有一定的可行性，可為簡(jiǎn)化Mo致病機(jī)制研究模型提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綿羊肺炎支原體;綿羊肺泡巨噬細(xì)胞;Raw 264.7細(xì)胞;細(xì)胞模型

中圖分類號(hào)：Q233

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1244-08

0引言

【研究意義】綿羊肺炎支原體（Mycoplasmaovipneumoniae，Mo）是造成綿羊傳染性胸膜肺炎的主要致病菌[1]，除綿羊外，Mo在山羊、大角羊及其他野生小反芻動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)[2-4]。Mo通過(guò)氣溶膠或飛沫在羊群中傳播，患病羊常表現(xiàn)出高熱、咳嗽、貧血、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，漸進(jìn)性消瘦和肺間質(zhì)增生等癥狀[5]。近年來(lái)，寧夏、甘肅、四川、新疆等地均有綿羊支原體肺炎的病例報(bào)道，其傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、死亡率高，給羊養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失[6，7]。然而，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Mo致病機(jī)理的研究較為有限，對(duì)防控Mo感染的研究尚未取得突破性進(jìn)展。在Mo研究過(guò)程中，綿羊體型較大，使用成本較高，是Mo致病機(jī)理研究受限的因素之一。應(yīng)用模式動(dòng)物（如小鼠、斑馬魚(yú)、非洲爪蟾等）構(gòu)建動(dòng)物/細(xì)胞模型是一種非常典型的生物學(xué)研究模式，模式動(dòng)物的生命活動(dòng)過(guò)程在一定程度上可以成為人體、珍稀物種或體型龐大物種相應(yīng)研究的參照。小鼠及小鼠的細(xì)胞系作為目前使用最廣泛的哺乳動(dòng)物/細(xì)胞模型，廉價(jià)易得，且生物學(xué)背景已被研究得較為詳盡，因此將其替代綿羊作為動(dòng)物/細(xì)胞模型用于研究Mo感染的致病機(jī)理具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要參與者，它可以吞噬并殺傷入侵的病原微生物，釋放炎癥因子，還能通過(guò)抗原遞呈調(diào)節(jié)T細(xì)胞而參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8]，在抵抗Mo感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9]。有研究顯示，NOD2/c-Jun NH 2終端激酶能夠觸發(fā)綿羊肺炎支原體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞白噬[10];肺炎支原體已被證明其能夠與巨噬細(xì)胞相互作用，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。綿羊原代巨噬細(xì)胞難以分離、不易培養(yǎng)（容易污染）、不能傳代，加大了Mo相關(guān)研究的難度，因此選擇能夠替代綿羊原代巨噬細(xì)胞的細(xì)胞模型對(duì)于加快Mo的研究進(jìn)程尤為重要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞系具有遺傳背景清晰、可傳代及易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于病原與宿主巨噬細(xì)胞互作的研究中[11]。Jiang等用純化的重組蛋白綿羊肺炎支原體上的延伸因子Tu（rEF-Tu）和熱休克蛋白70（rHSP70）免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示：支原體衍生脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白能夠通過(guò)TLR2信號(hào)誘導(dǎo)小鼠內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的分泌[12]。另外，Luo等利用小鼠巨噬細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)綿羊肺炎支原體能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生白噬[10]。雖然已有研究將小鼠巨噬細(xì)胞用于綿羊肺炎支原體致病機(jī)理的研究中，但小鼠巨噬細(xì)胞模型能否替代綿羊原代巨噬細(xì)胞應(yīng)用于綿羊支原體肺炎的研究尚缺少系統(tǒng)的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究分別應(yīng)用綿羊原代巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7細(xì)胞系構(gòu)建Mo感染模型，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)或RT-PCR檢測(cè)綿羊原代巨噬細(xì)胞和Raw 264.7細(xì)胞感染Mo后相關(guān)分子與通路的表達(dá)變化，從而探討小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7作為細(xì)胞模型應(yīng)用于Mo相關(guān)研究的可行性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞（分離白1.5～2歲齡綿羊肺臟組織）、小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7（購(gòu)白中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）;Mo標(biāo)準(zhǔn)株Y98由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;所用引物均由上海Sangon Biotech公司合成。

胎牛血清和DMEM均購(gòu)白美國(guó)Gibco公司;青霉素-鏈霉素、馬血清購(gòu)白中國(guó)Hyclone公司;支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)購(gòu)白青島海博生物有限公司;RNA提取試劑盒購(gòu)白美國(guó)Omega公司;反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBRPremix Ex TaqTM購(gòu)白日本Takara公司;CD14抗體、β-actin抗體及熒光二抗等均購(gòu)白Proteintech公司;激光共聚焦顯微鏡來(lái)源于德國(guó)Leica公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用QuantStudio?5系統(tǒng)完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的分離鑒定 取新屠宰綿羊的肺臟，向其支氣管處灌入適量無(wú)菌PBS緩沖液沖洗肺臟內(nèi)部，此過(guò)程中輕揉肺臟5～10min，充分沖洗出游離的綿羊肺泡巨噬細(xì)胞，反復(fù)沖洗4次后經(jīng)單層無(wú)菌紗布過(guò)濾沖洗液，將濾液經(jīng)300g離心5min收集細(xì)胞。然后，將收集的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后用含有15%胎牛血清、2.5μg-mL-1兩性霉素B、100μg·mL-1氨芐青霉素、25μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸，置于37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，收集上清液以除去先貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞和沉淀的組織殘?jiān)?。隨后，將細(xì)胞上清液300g離心5min后用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸并進(jìn)行分皿培養(yǎng)，從而獲得綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞。利用巨噬細(xì)胞特異性表面抗原CD14對(duì)分離得到的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。

1.2.2Mo進(jìn)入綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7后的定位 分別收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7懸液，以1×104cell·mL-1的密度接種于鋪有無(wú)菌細(xì)胞爬片的24孔板中培養(yǎng)6～8h，使其貼壁生長(zhǎng)于細(xì)胞爬片上。將經(jīng)DiO綠色熒光染料染色的Mo菌體（具體參照翊圣40725ES10產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作）分別加入至綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7中，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12h，隨后，將細(xì)胞爬片用PBS清洗5次，每次5min，以除去吸附在細(xì)胞上的Mo。然后將爬片分別經(jīng)4%多聚甲醛室溫下固定30min;0.3%Triton X-100的PBS緩沖液室溫下通透20min;BSA室溫封閉30min后加入200μL以1：100比例稀釋的β-actin抗體，4℃避光過(guò)夜孵育。次日將細(xì)胞爬片經(jīng)PBS清洗后，加入300μL以1：1000比例稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育1h，經(jīng)PBS緩沖液清洗后加入適量抗熒光淬滅的DAPI染液染核封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3Mo的培養(yǎng)及菌體收集 培養(yǎng)基配方為：支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)（33g·L-1），滅活馬血清（200 mL·L-1），青霉素（200IU·mL-1），5%醋酸鉈（4mL·L-1），丙酮酸鈉（2g·L-1），用1mol·L-1NaOH將pH調(diào)至7.4左右，混勻后-4℃保存?zhèn)溆?。?80℃超低溫冰箱中取出1mL凍存的Mo標(biāo)準(zhǔn)株Y98菌液，按照1：5的比例加入到預(yù)先配好的液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后12000r·min-1離心10min收集菌體，然后用PBS緩沖液離心洗滌3次進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4蛋白質(zhì)組學(xué)分析 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制成懸液，以5×106cell·mL-1的密度接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h使其貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，用Mo菌株感染綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞24h，提取細(xì)胞總蛋白。對(duì)提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，通過(guò)iTRAQ的高效液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜法（HPIC-MSIMS）對(duì)每個(gè)蛋白樣品進(jìn)行液相分離和質(zhì)譜分析。隨后，采用MaxQuant軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量分析，以倍數(shù)上調(diào)>2倍或下調(diào)<0.5倍，且P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白質(zhì)，并進(jìn)行差異蛋白聚類分析及差異蛋白GO功能的富集分析，進(jìn)一步利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定差異蛋白中顯著性富集的Pathway。

1.2.5細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR分析 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Raw264.7細(xì)胞以5×106cell·mL-1的密度接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h使其貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，用Mo菌株感染Raw264.7細(xì)胞24h。然后根據(jù)Omega 6834-01產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取總RNA并通過(guò)NanoDrop 8000和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa PrimeScript TM RT reagent Kit）提供的條件獲取cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10μL）：5×PrimeScriptBuffer 2μL; PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL;Oligo dT Primer 50 μmoI·L-1 0.5μL; Random 6 mers100μmol·L-1 0.5μL; Total RNA 1μg; RNase FreedH2O添加至10μL，反應(yīng)條件：37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5s，4℃延伸后放置于冰上;隨后，根據(jù)試劑盒（TaKaRa TB Green ？ Premix Ex TaqTMII）提供的條件進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)體系（20μL）：TB Green Premix Ex Taq II 10μL; PCR ForwardPrimer（10μmoI·L-1）0.8μL; PCR Reverse Primer（10μmol·L-1）0.8μL; cDNA 2μL; RNase Free dH2O添加至20μL，反應(yīng)條件：95℃15s;95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán);以GAPDH為內(nèi)參基因，各處理進(jìn)行3次重復(fù)，采用2-△△Ct值方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0和Graph Pad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞的分離鑒定

將分離得到的形態(tài)單一、生長(zhǎng)良好的綿羊肺臟細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)果如圖1-A：分離到的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的橢網(wǎng)形，細(xì)胞核質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯，表現(xiàn)出典型的巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)特性。為了進(jìn)一步鑒定其是否為綿羊肺泡巨噬細(xì)胞，利用CD14抗體對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，觀察其是否存在巨噬細(xì)胞特異性表面抗原CD14，結(jié)果如圖1-B：大部分細(xì)胞均被CD14抗體標(biāo)記，說(shuō)明分離到的綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞純度較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2Mo進(jìn)入綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7后的定位

為了對(duì)比Mo感染綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7后在兩種細(xì)胞內(nèi)定位的差異，利用DiO綠色熒光染料標(biāo)記Mo菌體，利用β-actin抗體分別標(biāo)記綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)Mo的分布進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖2。DiO標(biāo)記（綠色）的Mo菌體均可以進(jìn)入綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞中（紅色為β-actin抗體標(biāo)記的細(xì)胞骨架），且主要位于細(xì)胞質(zhì)中。表明Mo進(jìn)入巨噬細(xì)胞這一現(xiàn)象在小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7和綿羊肺泡巨噬細(xì)胞中具有一致性，推測(cè)Mo進(jìn)入巨噬細(xì)胞這一現(xiàn)象可能與巨噬細(xì)胞來(lái)源無(wú)關(guān)。

2.3綿羊肺泡巨噬細(xì)胞感染Mo后相關(guān)分子表達(dá)變化

為了探究綿羊肺泡巨噬細(xì)胞感染Mo后相關(guān)分子的表達(dá)變化差異，以未感染Mo的綿羊原代巨噬細(xì)胞為對(duì)照組，以感染Mo的綿羊原代巨噬細(xì)胞為處理組，對(duì)其進(jìn)行差異蛋白聚類分析（圖3-A）及差異蛋白GO功能的富集分析，結(jié)果如圖3-B～E：與對(duì)照組相比，Mo感染組Toll樣受體信號(hào)通路中FADD、CD86等蛋白、MAPK信號(hào)通路中p38、ERK等蛋白、白噬作用中CD11b、PKC等蛋白及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用中THBS1、CD36等蛋白的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。這些分子主要與巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答、凋亡以及自噬等生物過(guò)程相關(guān)。說(shuō)明綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞感染Mo后其Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、ECM受體相互作用及自噬作用途徑可能被激活或被抑制。

2.4小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染Mo后相關(guān)分子的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步探究綿羊肺泡巨噬細(xì)胞感染Mo后發(fā)生顯著變化的相關(guān)分子在小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染模型中的差異，采用RT-qPCR將篩選出的基因在Raw264.7細(xì)胞中進(jìn)行分析，對(duì)每個(gè)目標(biāo)基因分別進(jìn)行3次獨(dú)立檢測(cè)。結(jié)果如圖4-A-D：與對(duì)照組相比，Mo感染組FADD、CTSK、IL-1β、THBS1及MARCKS等基因的mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化。證明Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、ECM受體相互作用及自噬作用途徑同樣參與了Mo感染小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7的過(guò)程，且與Mo感染綿羊肺泡巨噬細(xì)胞的結(jié)果基本一致，提示Raw264.7細(xì)胞具有替代綿羊肺泡巨噬細(xì)胞成為研究Mo致病機(jī)制細(xì)胞模型的可能性。

2.5綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染Mo后相關(guān)分子表達(dá)變化的比較

為了更加直觀地表示綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染Mo后相關(guān)分子表達(dá)變化的差異，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果繪制了綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染Mo后相關(guān)分子表達(dá)差異比較圖（圖5）。圖中橙色代表上調(diào)表達(dá)的基因，綠色代表下調(diào)表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，與綿羊肺泡巨噬細(xì)胞相比，小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7感染Mo后，與巨噬細(xì)胞功能密切相關(guān)的部分信號(hào)通路中FADD、IL-1β、NOS2、THBS1、FcyR1、AAIAR CKS等分子的表達(dá)發(fā)生顯著改變，且變化趨勢(shì)與綿羊原代肺泡巨噬細(xì)胞感染Mo后的結(jié)果一致，這些分子主要涉及Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及ECM受體相互作用，主要參與巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答、凋亡及自噬等相關(guān)生物過(guò)程，且Mo對(duì)兩類細(xì)胞中這些通路的影響基本一致。小鼠巨噬細(xì)胞中ERK1/2、TGF-β、PKC、CD36基因的相對(duì)表達(dá)與綿羊巨噬細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化不一致，猜想可能小鼠巨噬細(xì)胞和綿羊巨噬細(xì)胞受到Mo感染之后部分細(xì)胞因子的表達(dá)具有差異，也可能因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后調(diào)控使得基因表達(dá)與蛋白表達(dá)有部分差異，具體原因需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

3 討論與結(jié)論

目前大量研究顯示，動(dòng)物支原體如人支原體[13]、羊支原體[14]、雞毒支原體[15]、豬支原體[16]等均能夠引起其宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致呼吸道損傷。此過(guò)程中涉及多種信號(hào)通路的參與及調(diào)控。其中Toll樣受體（Toll Like Receptor，TLR）作為主要的免疫識(shí)別受體，其在Mo感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TLR2和TLR4是支原體感染中關(guān)鍵的受體，可通過(guò)MyD88途徑或TRIF途徑激活免疫應(yīng)答，在肺炎支原體感染中發(fā)揮雙重作用[17]，即誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)從而清除肺炎支原體或引起過(guò)度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺炎支原體并發(fā)癥。Zhang等分別通過(guò)人支原體感染THP-1細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞和原發(fā)性腹膜巨噬細(xì)胞來(lái)分析TIPE2（腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白）的表達(dá)變化，結(jié)果表明：免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑TIPE2能夠通過(guò)MAPK信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)人支原體肺炎觸發(fā)的免疫反應(yīng)[18]。并且Hwang等證實(shí)NF-κB和MAPK信號(hào)通路參與了豬肺炎支原體誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子和NO的上調(diào)過(guò)程[19]。另外，Lu等的研究也顯示巨噬細(xì)胞受到雞毒支原體的感染會(huì)誘發(fā)其自噬的發(fā)生[20]。

本研究分別以綿羊肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7構(gòu)建Mo感染的細(xì)胞模型，通過(guò)對(duì)Mo和細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的Mo在兩種細(xì)胞中具有相同的細(xì)胞定位。蛋白質(zhì)組學(xué)或RT-qPCR對(duì)兩種細(xì)胞感染Mo后免疫防御功能相關(guān)分子表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明在Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等的研究中，兩種細(xì)胞的部分蛋白或基因的相對(duì)表達(dá)變化基本一致，但也有少數(shù)基因，如ERK1/2、TGF-β、PKC、CD36具有細(xì)微差異，猜想可能與細(xì)胞本身或者細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控有關(guān)，具體造成差異的原因需要進(jìn)一步探究。本研究提示使用Raw 264.7細(xì)胞系替代綿羊原代巨噬細(xì)胞用于研究Mo對(duì)巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及ECM作用的調(diào)控機(jī)制具有一定的可行性，但二者與Mo的其他互作機(jī)制差異則需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)探究。

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（責(zé)任編輯 ：張梅）

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收稿日期：2020-06-12初稿：2020-09-04修改稿

作者簡(jiǎn)介：張穎（1996-），女，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)（E-mail： 1776244258@qq.com）

*通信作者：高力揚(yáng)（1981-），女，博士，講師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)（E-mail：pandarun@nxu.edu.cn）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960036、31460039）;教育部“春暉計(jì)劃”國(guó)際合作項(xiàng)目（NXU201802）