葉若柏　吳珍紅　繆曉青

摘要：【目的】探討在巰乙基磺酸鈉（MESNa）與碳酸氫銨（NH4HCO3）存在下，對(duì)在大腸桿菌上表達(dá)的重組融合蛋白中內(nèi)含肽（Intein）用硫醇（DTT）進(jìn)行自剪切，促使抗菌肽（MME）碳末端實(shí)現(xiàn)酰胺化?！痉椒ā繕?gòu)建用大腸桿菌表達(dá)內(nèi)含肽介導(dǎo)的MME重組質(zhì)粒，通過表達(dá)獲得依次由“組氨酸、Sumo標(biāo)簽、MME、內(nèi)含肽”構(gòu)成的融合蛋白，用鎳柱及透析進(jìn)行純化，在MESNa和NH4HC03存在下，用DTT對(duì)內(nèi)含肽進(jìn)行白剪切，促使MME碳末端酰胺化，腸激酶切割、純化，得到碳末端酰胺化的MME。質(zhì)譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，檢測(cè)MME及其碳末端酰胺化?！窘Y(jié)果】通過PCR，鑒定融合蛋白，其基因片段為837bp，符合預(yù)期。質(zhì)譜鑒定得MME相對(duì)分子量為3057.7與其理論值3057.64一致。二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)得MME碳端碎片的分子量為1214.728，與碳末端酰胺化的MME碳端碎片理論分子量1214.739相符，匹配度為45，表明本研究制備的MME碳末端已被酰胺化，該蛋白為可溶?！窘Y(jié)論】用大腸桿菌成功地表達(dá)了重組融合蛋白，在MESNa與NH4HCO3存在下，促進(jìn)了內(nèi)含肽白剪切，MME碳末端被酰胺化，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單的“一步法”制備。質(zhì)譜與二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，可靈敏、簡(jiǎn)單地對(duì)碳末端酰胺化多肽進(jìn)行檢測(cè)，可作為該項(xiàng)檢測(cè)方法的一種選擇，結(jié)果表明，本研究成功地制備了碳末端酰胺化的MME。

關(guān)鍵詞：抗菌肽;酰胺化;內(nèi)含肽介導(dǎo);自剪切

中圖分類號(hào)：S816.75

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（2020）11-1265-06

0引言

【研究意義】抗生素過度使用出現(xiàn)的食品藥殘和細(xì)菌耐藥性問題[1]，使畜禽飼養(yǎng)中抗菌問題遇到了極大麻煩?？咕模ˋntimicrobial peptides，AMPS）抗菌譜廣，細(xì)菌不大可能對(duì)其耐藥[2]。但要使AMPS產(chǎn)業(yè)化，主要還面臨著要提高其活性[3]和半衰期，降低其毒性和生產(chǎn)成本。本課題組設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了抗菌能力強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)、毒性低的碳末端酰胺化的抗菌肽（MME），其氨基酸序列為：GRGDSPKFLHSAKKFGKAFPAVLKVLTTG[4]。本研究探討通過基因工程表達(dá)法，生產(chǎn)目標(biāo)抗菌肽MME以期降低生產(chǎn)成本?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】獲得AMPS方法有3種：從生物體中提取、化學(xué)法合成和基因工程表達(dá)，其中第三種方法成本最低[5]。基因工程表達(dá)系統(tǒng)有多種，其中大腸桿菌（E.coli）表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)明顯，因此被廣泛采用[6]。碳末端酰胺化的AMPS在人體內(nèi)有重要的生理功能，其碳端末端的α-酰胺基對(duì)AMPS的活性起著很重要作用，有些AMPS在酰胺化前后的生物活性相差可達(dá)萬倍[7];其還可起保護(hù)作用，減弱蛋白酶對(duì)AMPS的降解，延長(zhǎng)AMPS的半衰期[8]。可是大腸桿菌直接表達(dá)的多肽產(chǎn)物碳末端均為羥基。為此，研究者提出先用基因工程手段表達(dá)碳末端為羥基的多肽，然后再進(jìn)行第二步的酰胺化修飾，最終獲得碳末端酰胺化的目標(biāo)多肽。如：重組表達(dá)α-酰胺化酶在體外進(jìn)行多肽C端酰胺化，用溴化氰裂解融合表達(dá)產(chǎn)物所得的鮭魚降鈣素的體外酰胺化加工。但這些工藝都存在一些不足，前者在酰胺化過程中需提供酰胺化工具酶，制備中純化步驟多，技術(shù)要求較高，成本較大[9];后者在酰胺化過程中要使用溴化氰[10]，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，制約了他們的大規(guī)模生產(chǎn)?，F(xiàn)在研究者仍投入大量精力，以期開發(fā)出更完善的工藝[7]。存在于前體蛋白結(jié)構(gòu)中的內(nèi)含肽（Intein）序列，能從前體蛋白中白我剪切，還能將剪切下的兩側(cè)肽鏈連成肽鍵。Li Yifeng[11]對(duì)內(nèi)含肽的生物應(yīng)用做了較全面的介紹，周冠、俞超等[7，12]用內(nèi)含肽介導(dǎo)表達(dá)天蠶素多肽，僅用硫醇DTT對(duì)表達(dá)的融合蛋白中含有的內(nèi)含肽進(jìn)行自剪切，同時(shí)使融合蛋白中含有的抗菌肽碳末端實(shí)現(xiàn)酰胺化。Stevens A J[13]在用DTT使內(nèi)含肽自剪切時(shí)，加入了NH4HC03，以利于多肽碳末端的酰胺化。對(duì)碳末端酰胺化的抗菌肽的檢測(cè)，也是困擾研究者的又一大問題[14]?！颈狙芯壳腥它c(diǎn)】前人研究表明，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終要獲得碳末端酰胺化的AMPS還存在不少困難，主要問題是促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物碳末端的酰胺化。通過酰胺化酶對(duì)大腸桿菌表達(dá)所得前體蛋白進(jìn)行酰胺化與用化學(xué)合成制備法比較，雖可簡(jiǎn)化純化工藝[14]，但需二步法制備[7]，過程仍較復(fù)雜;用內(nèi)含肽介導(dǎo)在大腸桿菌上表達(dá)含MME的融合蛋白，通過DTT實(shí)現(xiàn)內(nèi)含肽白剪切，雖可實(shí)現(xiàn)一步法制備碳末端酰胺化多肽，但酰胺化過程困難[7，12]。本研究探討在上述酰胺化體系中，引入巰乙基磺酸鈉（MESNa）和碳酸氫銨（NH4HCO3），促進(jìn)MME碳末端酰胺化的進(jìn)行;將質(zhì)譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，鑒定MME，并檢測(cè)其碳末端酰胺基的存在?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究探討在MESNa和NH4HCO3存在下，用DTT對(duì)內(nèi)含肽進(jìn)行白剪切，促進(jìn)多肽碳末端酰胺化;將質(zhì)譜與二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，希望能探索一種靈敏、簡(jiǎn)單地檢測(cè)AMPS碳末端酰胺化的方法，促進(jìn)對(duì)多肽碳末端酰胺化的研究。

1材料與方法

1.1主要試劑、儀器及材料

1.1.1主要試劑與儀器 質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒（天根生物公司），NdeI、XhoI和腸激酶（EK）[TaKara（大連）公司]，蛋白maker[TaKara（大連）公司]，大腸桿菌BL21（DE3）（本室保存），PET30a（本室保存），6×His標(biāo)簽抗體（上海生工），IPTG、硫醇（DTT）（Solarbio），Ni-NTA beads 6FF（天地人和公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純，電泳系統(tǒng)、成像系統(tǒng)（Tahon），半干電轉(zhuǎn)儀（Tahon），紫外可見分光光度計(jì)（日本HITACHI），高效液相-電噴霧質(zhì)譜（ Aglient）。

1.1.2主要溶液配制 緩沖溶液Buffer簡(jiǎn)記：Buf，Buf A中DTT濃度為1mmol·L-1，Buf（B、C、D）中咪唑濃度分別為20mmol·L-1、40mmol·L-1和500mmol·L-1，上述緩沖液的NaCI、Na3PO4濃度分別為500mmol·L-1和25mmol·L-1， pH=7.5;Buf（E、F、G、H）中咪唑濃度分別為0、20mmol·L-1、40mmol·L-1、250mmol·L-1，上述緩沖液中的Tris、NaCl、甘油的濃度分別為20mmol·L-1、300mmol·L-1和10%，pH=8.0。

1.2表達(dá)載體的建立、合成

Sumo標(biāo)簽常作為融合標(biāo)簽，它是由一系列特定的氨基酸組成，在表達(dá)過程中可促進(jìn)靶蛋白的正確折疊，提高重組蛋白表達(dá)量。本研究構(gòu)建由“組氨酸標(biāo)簽+Sumo標(biāo)簽+MME+內(nèi)含肽”組成的融合蛋白基因，為使腸激酶（EK）能識(shí)別切割位點(diǎn)，在Sumo標(biāo)簽和MME之間設(shè)置DDDDK（天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸），以便將MME從表達(dá)的融合蛋白中切割下來。在融合蛋白基因的兩側(cè)設(shè)置酶識(shí)別位點(diǎn)（Ndel-XhoI），以連接表達(dá)載體。將MME基因序列針對(duì)大腸桿菌偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，合成基因至pET30a載體中構(gòu)成重組質(zhì)粒（委托杭州生物科技公司）。將其熱激轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌后，將其鋪展于含抗性的LB板上，在37℃下恒溫16h。

從平板上挑取陽性單克隆，抽提質(zhì)粒，通過上游引物：ATGCATCATCATCATCACCATGGTA GCGATAG和下游引物：ATTACTGGCAACCAGGCCGTTTTTC（委托上述公司合成），進(jìn)行融合蛋白基因片段PCR擴(kuò)增。陽性單克隆菌株委托大連生物公司（Takara）測(cè)序。

1.3融合蛋白表達(dá)、純化及鑒定

取1.2中的重組菌，將其轉(zhuǎn)入含抗生素的LB液中，37℃、220r·mm-1培養(yǎng)15h后，以1：90（體積比）接種至LB培養(yǎng)液中，測(cè)得A600約為0.8時(shí)，在IPTG濃度為0.2mmol·L-1、15℃下，震蕩誘導(dǎo)18h。離心并將菌體重懸浮于BufA中。取少量懸浮液超聲破碎，離心后分別制備沉淀與上清樣品。其余加Ni-NTA（10mL），破碎，置4℃純化2h，轉(zhuǎn)移至空柱管內(nèi)，排出流出液后，依次用Buf B、Buf C清洗，用BufD洗脫，分別得各試樣。

1.4 DTT剪切、EK酶切及其Ni柱純化

將經(jīng)BufD洗脫樣透析至BufA中，加入終濃度為50mmol·L-1的DTT，再加MESNa至終濃度為100mmol·1-1，25℃反應(yīng)48h，再加入終濃度為1mol·L-1的NH4HCO3，并調(diào)節(jié)PH為8.5，4℃反應(yīng)16h。將反應(yīng)產(chǎn)物透析至BufE中，加Ni-NTA（5mL），4℃純化1h。將其轉(zhuǎn)入空柱管內(nèi)，收集流出液，依次用BufF、BufG清洗，用BufH二次洗脫，將洗脫液透析至BufE中，加適量EK混勻，4℃反應(yīng)15h，取酶切后樣品，往上述酶切液中加入Ni-NTA（5mL）純化后，轉(zhuǎn)移至空柱管內(nèi)，收集流出液（產(chǎn)物MME）。

1.5質(zhì)譜鑒定MME

參考周冠[7]的方法，對(duì)經(jīng)內(nèi)含肽白剪切和EK切割并經(jīng)純化的樣品MME進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.6二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定DTT剪切位置

將經(jīng)DTT處理及親和純化的樣品用2%乙腈和0.1%的甲酸充分溶解。在Eksigent 425+TripleTOF6600液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng)上進(jìn)行分析（委托中國科學(xué)院遺傳研究所分析）。多肽富集柱型號(hào)為200μm×0.5mmChromXP C18-CL 3μm120A，分析柱為75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm 120A，流動(dòng)相A為95%水+5%乙腈+0.1%甲酸，流動(dòng)相B為95%乙腈+5%水+0.1%甲酸，富集柱流速為3μL·min-1，分析柱流速為300nL·mmin-1。質(zhì)譜采集參數(shù)：一級(jí)譜圖采集范圍為（m/z）350-1500，采集累計(jì)時(shí)間為250ms;候選母離子為40個(gè)，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為22s，二級(jí)譜圖采集范圍為（m/z）100-1500，采集累計(jì)時(shí)間為75ms;離子源電壓為2.4kv，GS1為5，簾氣為35，去簇電壓為80，CES為5。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增融合蛋白基因片段

由圖1可見，PCR擴(kuò)增的融合蛋白的基因片段為837bp，符合預(yù)期。測(cè)序結(jié)果也符合原設(shè)計(jì)，表明成功地構(gòu)建了表達(dá)載體。

2.2融合蛋白表達(dá)、鑒定

由圖2可見，泳道（1-6）的樣品中，主要是摩爾質(zhì)量為32KD左右的表達(dá)產(chǎn)物，這與所設(shè)計(jì)的融合蛋白的理論分子量一致。該蛋白的溶解性好。各泳道條帶清晰，表明融合蛋白含量較高，其中上清液樣品和流出液樣品的條帶拖帶情況較嚴(yán)重，其雜質(zhì)含量較高。經(jīng)過純化之后的樣品條帶基本無拖帶，蛋白純度較高。

2.3表達(dá)多肽（MME）的酰胺化及純化

圖3可見，表達(dá)的融合蛋白在MESNa和NH4HCO3存在下，通過內(nèi)含肽白剪切和EK切割可得分子量約為3.1KD的表達(dá)產(chǎn)物，與酰胺化MME的分子量一致。

2.4質(zhì)譜鑒定MME分子量

用質(zhì)譜表征樣品MME得圖4，圖4中MME的高豐度離子峰的質(zhì)荷比為612.55，則相對(duì)分子量為3057.7，與其理論分子量3057.64一致。

2.5二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜表征MME酰胺化

用二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定樣品，得表1[表中2824碎片：Amidated-酰胺化;（Protein C-term）-蛋白碳端末端]。由表1可知，2824號(hào)碎片[K.AFPAVLKVLTTG.-+Amidated（Protein C-term）]與2841號(hào)碎片（K.AFPAVLKVLTTG.-）它們的氨基酸序列相同，僅是前者碳末端為氨基，后者為羥基，氨基分子量為16，羥基分子量為17，故它們的分子量相差1，這表明2824號(hào)碎片碳末端被酰胺化，結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果，可知樣品中存在碳末端被酰胺化的MME。

用二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定樣品，還可得圖5，2824號(hào)碎片在離子流色譜中的保留時(shí)間為43.158min，由圖5可知，該碎片的離子流色譜峰面積為1846，通過峰面積歸一化法，可得2824號(hào)碎片的含量為20%左右，表明樣品中還含有雜質(zhì)。還后續(xù)將繼續(xù)探討優(yōu)化工藝指標(biāo)。

通過質(zhì)譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，對(duì)MME的檢測(cè)，表明試驗(yàn)成功地制備了碳末端酰胺化的MME。

3討論與結(jié)論

如前所述的“一步法”[7，12]，僅通過DTT使融合蛋白中的內(nèi)含肽進(jìn)行白剪切。本研究在DTT對(duì)內(nèi)含肽進(jìn)行自剪切的體系中，引入了MESNa和NH4HCO3，這樣在體系中就能同時(shí)產(chǎn)生2種反應(yīng)：一種是按上述反應(yīng)[7，12]進(jìn)行，另一種以圖6所示的歷程進(jìn)行[15]。

“一步法”制備中，通過內(nèi)含肽的白剪切，實(shí)現(xiàn)多肽的酰胺化是過程的關(guān)鍵步驟，這樣當(dāng)2種反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行時(shí)，將促進(jìn)平衡往產(chǎn)物方向移動(dòng)，有利于多肽碳末端酰胺化的進(jìn)行[15]。

一種制備過程的建立，必須要有對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，才有對(duì)所研究問題的評(píng)價(jià)基礎(chǔ)，但對(duì)抗菌肽碳末端酰胺化結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法至今還不完善。建立在質(zhì)譜與特異性抗體檢測(cè)基礎(chǔ)上的“斑點(diǎn)印跡”法[14]，僅適用于酰胺化過程中要除去碳末端一個(gè)氨基酸的“二步法”制備;“毛細(xì)管電泳”法[16]由于重現(xiàn)性差，影響了其應(yīng)用。多肽的酰胺化存在轉(zhuǎn)化率的問題，其碳末端已被或未被酰胺化多肽的分子量?jī)H相差“1”，這已落人質(zhì)譜測(cè)量的誤差范圍，因此僅用質(zhì)譜鑒定分子量的方法來研判所得酰胺化多肽產(chǎn)物是不妥的。本研究用二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)碳末端酰胺化抗菌肽，通過將感興趣的多肽碳端碎片入選為二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜的候選母離子，精確測(cè)量其分子量，并通過離子峰面積歸一化計(jì)算，可研判產(chǎn)物酰胺化效果。本法在結(jié)構(gòu)上找到依據(jù)，從理論上證明多肽碳末端是否酰胺化。該法靈敏度高，方法簡(jiǎn)單。

本研究用大腸桿菌為工程菌表達(dá)前體蛋白，通過DTT對(duì)內(nèi)含肽白剪切時(shí)，引入MESNa和NH4HCO3，可促進(jìn)酰胺化的進(jìn)行[15]，所得抗菌肽溶解性好;并提供了將質(zhì)譜與二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，鑒定碳末端酰胺化的抗菌肽，試驗(yàn)所得酰胺化碳端2824號(hào)碎片含量為20%左右。該法是對(duì)碳末端酰胺化多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)的一種靈敏、簡(jiǎn)單的方法。試驗(yàn)表明，本研究用簡(jiǎn)單的一步法成功地制備了碳末端酰胺化的抗菌肽MME。

致謝：感謝杭州生物科技公司張建飛老師對(duì)本試驗(yàn)提供的幫助。

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（責(zé)任編輯：吳宇琳）

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收稿日期：2020-10-10初稿;2020-11-05修改稿

作者簡(jiǎn)介：葉若柏（1979-），男，講師，碩上，在讀博士生，研究方向：藥物生物技術(shù)（Email： 354650728@qq.com）

*通信作者：繆曉青（1959-），男，碩上，教授，博上生導(dǎo)師，研究方向：天然生物毒素提取、改性及利用研究（E-mail： mxqsf88@126.com）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51202030）