陳建華　張碧堯　李丹佩　陳世紅　謝艷穎　王國紅

摘要：【目的】研究壬基酚（NP）對赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）的生態(tài)脅迫效應，并探討茶多酚對NP引發(fā)蚯蚓生態(tài)脅迫的緩解作用?！痉椒ā坎捎米匀煌寥婪ㄑ芯咳苫樱∟P）對赤子愛勝蚯蚓的生態(tài)脅迫效應，通過在NP基礎液中添加不同質量分數(shù)的茶多酚，探討茶多酚對NP脅迫下蚯蚓生活狀態(tài)的影響、致死毒性、回避行為及生長抑制的緩解作用，同時采用HE組織切片染色法初步探討NP毒性的作用機理?！窘Y果】400mg·kg-1NP對蚯蚓具有強烈的致死毒性，100～200mg·kg-1NP對蚯蚓具有一定的致死毒性，其致死毒性與染毒時間、染毒量呈正相關;NP為200mg·kg-1時對蚯蚓生長抑制率達34%，具有顯著差異;通過組織切片試驗證實，NP脅迫下，蚯蚓空泡化腺細胞減少，環(huán)肌層變薄，角質層脫落，表皮層增厚;蚯蚓對12.5～200mg·kg-1的NP具有回避反應。在壬基酚基礎液中添加70～700μg·kg-1的茶多酚后，蚯蚓致死率和生長抑制率均有顯著下降。0.7～7.0μg·kg-1的茶多酚能明顯緩解蚯蚓的回避反應。與NP對照組相比，添加0.7—700.O¨g.kg-l茶多酚后蚯蚓體壁環(huán)肌層厚度增加，角質層恢復光滑完整?！窘Y論】100～400mg·kg-1的NP對赤子愛勝蚯蚓具有生態(tài)毒性作用，0.7～700.0μg·kg-1的茶多酚對NP脅迫蚯蚓生態(tài)毒性具有緩解作用。

關鍵詞：壬基酚;蚯蚓;茶多酚;生態(tài)毒性;緩解作用

中圖分類號：Q89

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）11-1271-09

0引言

【研究意義】壬基酚（ Nonylpheol，NP）是壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol polyethylene glycol ether，NPEO）的生物降解產(chǎn)物，在工業(yè)、農業(yè)以及日常生活中大量存在[1]。隨著NPEO類農藥的噴灑、污水灌溉以及淤泥填肥，土壤中的NP污染日益嚴重[2]?，F(xiàn)已知NP在土壤中具有強吸附性、難淋溶和移動性差的特點，而且在土壤中的半衰期可高達60年[3]。土壤中NP對土壤生物的影響具有持久性，研究NP污染治理具有現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】作為一種環(huán)境雌激素，NP的分子結構與雌二醇相似，進入牲畜或人體后，可與機體中的雌二醇競爭結合受體，干擾內分泌功能[4]。目前已知土壤中長期存在的NP不僅可以向農作物遷移，而且能在蚯蚓等土壤動物體內蓄積，不僅影響土壤生物的生存、生長和產(chǎn)量，同時易通過農作物的富集，最終進入牲畜與人體體內，發(fā)揮其毒性作用[5-7]。茶多酚是茶葉中提取的天然物質，有強抗氧化、抗畸變、抗癌等作用。近年來，有關茶多酚與生物體內雌激素的相關作用引起了許多學者的廣泛興趣。有學者認為茶多酚能減少雌激素的代謝或減少雌激素與受體的結合[8-9]，這為阻斷環(huán)境雌激素與受體結合，進而解除或緩解由環(huán)境雌激素導致的毒性作用提供了新的思路。資料表明茶多酚對生物無積毒性和遺傳毒性，給生物機體補充茶多酚解毒時也不會引入新的毒性物質，這對于食物鏈頂端的人類而言是相當安全的[10]。目前將茶多酚作為畜禽飼料的食品添加劑也已在生產(chǎn)中得到了廣泛應用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以與銅在可變電荷土壤表面發(fā)生協(xié)同吸附，增加土壤對銅離子的吸附量，從而降低這類有毒金屬的活性[12]。同時蚯蚓作為評價化學品土壤污染生態(tài)效應研究的理想模式生物[13-17]，對土壤有機污染物比其他動物更加敏感[18-21]，是環(huán)境污染物生態(tài)毒性監(jiān)測的“哨兵”生物?！颈狙芯壳腥朦c】NP是類環(huán)境激素物質，具有生物致毒性，在水體、污泥、沉積物中普遍存在，且對食品安全構成威脅，但國內對土壤中壬基酚的殘留水平知之甚少。目前針對NP在土壤中的研究已經(jīng)有一些報道，包括吸附動力學[22]、縱向淋溶研究[23]、生物降解[24]等。然而目前有關NP對土壤生物生態(tài)毒性的研究卻鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以蚯蚓作為試驗材料，研究NP脅迫下赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）的生態(tài)毒性效應，并探討茶多酚對NP脅迫下蚯蚓生態(tài)毒性的緩解作用，以期為NP的防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗動物赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida），購自福建省福州市國藝花鳥工藝品市場，試驗前選擇體重300～400mg環(huán)帶明顯、健康的蚯蚓，放在自然土壤培養(yǎng)盒中，置于生長箱中預培養(yǎng)2周以上后用于試驗。試驗溫度為（20±2）℃，相對濕度≥80%;NP購自南京奧多福尼生物科技有限公司;助溶劑為無水乙醇，試驗用土購白國藝花鳥工藝品市場，自然土壤為黑色砂壤土，pH為6.8，含水量35%。

1.2試驗方法

1.2.1NP對蚯蚓的生態(tài)脅迫影響 試驗蚯蚓預處理：洗去蚯蚓身上的泥土，放置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，用扎孔的保鮮薄膜封口進行一晝夜的清腸，清腸后選取依然健康的蚯蚓進行試驗。毒性試驗采用自然土壤法。設清水對照、溶劑乙醇對照組和NP染毒組。配置成質量分數(shù)為25、50、100、200、400mg·kg-1的NP試驗用土，在100g試驗用土中加入10條已清腸的蚯蚓，室溫下培養(yǎng)14d。期間定期補充一定量清水維持土壤的濕度，觀察并記錄蚯蚓的生活狀態(tài)及死亡情況（以針刺尾部無明顯反應則判定為死亡）。

（1）毒性試驗：毒性試驗中的半致死質量濃度LC50和95%置信限采用寇氏法[25]，公式為如（1）所示：

LC50= log-1[Xm-i（∑P-0.5）]

（1）

式中，Xm是最大NP組的質量分數(shù)對數(shù)值，i是相鄰兩組對數(shù)質量分數(shù)的差值，P是各組蚯蚓死亡率，∑P是各組蚯蚓死亡率之總和。LC50的標準誤：

=——————一

SX50=i× √（∑P-∑p2）/（n-1）

式中，n是各組蚯蚓條數(shù)。

LC50的95%置信限=log-1（logLC50±1.96×SX50）。

有害物質毒性分級采用表1的標準。

（2）生長抑制率：在試驗第0、15d，收集存活的蚯蚓，清腸一晝夜后，稱量蚯蚓體重，計算蚯蚓生長抑制率：

C=W0-Wt/W0×100%

（2）

式中，C為生長抑制率;W0為試驗開始時蚯蚓體重;Wt第14d蚯蚓體重。

（3）體壁顯微結構：取毒性試驗14d中存活的蚯蚓，清腸24h，環(huán)帶前方0.5cm處剪取一段組織，Bouin's固定液中固定24h，經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后進行連續(xù)切片，厚度為7μm，晾干。之后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，蘇木精、伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察蚯蚓體壁顯微結構。

1.2.2蚯蚓對NP的回避反應 回避容器中央放置2塊相同的隔板，中間留有0.5cm空隙。取60g（干質量）土壤配成含NP12.5、50、200 mg·kg-1的試驗用土，放置于隔板一端，取60g（干質量）土壤配置清水（或乙醇）對照組放置于隔板另一側。于兩隔板中間放置20條清腸后的蚯蚓，抽去隔板，以扎孔的保鮮薄膜封口。培養(yǎng)48h后將隔板插入原位置，阻止蚯蚓進一步逃逸，手動挑出兩側土壤中的蚯蚓并計數(shù)。當蚯蚓位于隔板中間的縫隙時，則兩邊按0.5條計算，每個質量分數(shù)設3個重復?；乇苈视嬎愎饺缦拢?/p>

NR=[（C-T）/N]×100%

（3）

其中，NR為凈回避率，C為在清水一側的蚯蚓數(shù)目，T為在受試物（乙醇、NP、茶多酚）一側的蚯蚓數(shù)目，N為加入的蚯蚓總數(shù)。

1.2.3茶多酚對NP脅迫下蚯蚓的緩解和回避行為的緩解作用 設置NP對照組和茶多酚試驗組，以14d半數(shù)致死濃度95%置信下限的NP溶液為NP對照溶液，并在此NP溶液中添加茶多酚，配置茶多酚為0.7、7、70、700μg·kg-1的處理組，茶多酚對蚯蚓毒性損傷的緩解作用試驗的具體方法見1.2.1和1.2.2。

1.3數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 11.0系統(tǒng)軟件分析數(shù)據(jù)資料，采用線性回歸分析NP的質量濃度和毒性效應的關系，用相關系數(shù)R來表示相關程度。

2結果與分析

2.1NP對蚯蚓的生態(tài)脅迫影響

2.1.1NP對蚯蚓的致死毒性和生活狀態(tài)的影響 結果顯示：清水、乙醇對照組以及NP為25～50mg·kg-1組蚯蚓體表濕潤，行動迅速，無中毒癥狀，無死亡情況;NP為100～200mg·kg-1時對蚯蚓具有一定的毒性作用，主要表現(xiàn)為生活狀態(tài)較差，體型瘦小，應激運動能力較遲鈍，體表較干燥，NP為100～200mg·kg-1時對蚯蚓具有一定的致死效應，且NP對蚯蚓的致死效應與染毒時間和染毒量均呈正相關（表2）;蚯蚓對400mg·kg-1的NP敏感，蚯蚓剛接觸此量的NP土壤時即表現(xiàn)出強烈的回避反應，遲遲不肯入土，7d后的蚯蚓生活狀態(tài)極差，反應及運動能力極為遲緩，體表干燥，同時此含量NP對蚯蚓具有強烈的致死作用，于染毒的第5d就開始發(fā)揮致死作用，第14d致死率達100%。以NP質量分數(shù)為橫坐標對蚯蚓慢性致死率進行回歸分析，結果見表2，結果顯示第7d的LC50為292.817mg·kg-1，LC50>10mg·kg-1，按照土壤法毒性等級劃分標準，NP對蚯蚓的毒性等級為低毒。

2.1.2NP對蚯蚓生長的抑制影響 圖1顯示了暴露于NP14d的蚯蚓生長變化趨勢。結果發(fā)現(xiàn)：清水對照組和乙醇對照組中蚯蚓無生長抑制現(xiàn)象，與清水組比較，25mg·kg-1的NP也對蚯蚓的生長具有顯著的抑制，而且，隨著NP的升高，其對蚯蚓生長的抑制作用增強，200 mg·kg-1的NP對蚯蚓生長抑制率達34%，差異顯著。

2.1.3NP脅迫對蚯蚓體壁結構的損傷 染毒14d蚯蚓體壁顯微結果顯示：清水對照組角質層結構平滑、完整，表皮層柱狀上皮細胞排列緊密，其中存在少許擴大空泡狀的黏液腺細胞，環(huán)肌層厚度等于或大于表皮層厚度（圖2-A）。乙醇對照組表皮層細胞略有增厚，環(huán)肌層厚度約等于表皮層厚度（圖2-B）。與清水對照組相比，NP為25～50 mg·kg-1時，表皮層細胞增厚情況、環(huán)肌層厚度情況與乙醇對照組相似，25mg·kg-1NP組空泡化黏液腺細胞數(shù)量增多（圖2-C），50mg·kg-1NP組空泡化黏液腺細胞數(shù)量沒有增多，反而減少，少于清水對照組（圖2-D），同時部分角質層開始破損脫落（圖2-E）。100～200mg·kg-1NP組部分表皮層細胞增厚明顯，環(huán)肌層變薄，厚度小于表皮層，表皮層空泡化腺細胞數(shù)量少（圖2-F、H），同時100 mg·kg-1NP組的角質層薄而稀疏（圖2-G），200mg·kg-1NP角質層破損嚴重，部分角質層已完全脫落，柱狀上皮細胞裸露（圖2-1）。

2.2蚯蚓對NP毒性的回避反應

蚯蚓回避試驗草案[27]指出：當回避率（NR）為0時，污染物濃度為無效應濃度，當NR為負數(shù)時，表明蚯蚓對受試物無反應。當NR為正數(shù)時，表明蚯蚓對受試物具回避反應。計算回避率，當有80%以上的蚯蚓發(fā)生回避反應時，則表明受試物的存在不適宜蚯蚓的生存。NP脅迫下蚯蚓的回避試驗結果（圖3）顯示，蚯蚓對12.5～200mg·kg-1的NP具有一定的回避反應，且蚯蚓對NP的回避反應隨著NP的升高而加劇。試驗期間沒有發(fā)現(xiàn)蚯蚓死亡和逃逸現(xiàn)象。

2.3茶多酚對NP脅迫下蚯蚓的緩解作用

2.3.1茶多酚對NP脅迫下蚯蚓致死毒性的緩解作用

取毒性試驗中14d時LC50的95%置信下限NP溶液質量分數(shù)（100mg·kg-1）為NP對照溶液，并在此NP溶液中加入不同茶多酚進行保護試驗。結果表明（表3），NP對照組中的蚯蚓從第10d開始陸續(xù)死亡。加入茶多酚后14d，蚯蚓的死亡率顯著降低，茶多酚為7～700μg·kg-1時蚯蚓死亡率為0，全部存活，同時茶多酚組的蚯蚓體色與活動能力等各方面的生活狀態(tài)都有恢復。

2.3.2茶多酚對NP脅迫下蚯蚓生長毒性的緩解 圖4結果表明，在NP液中加入茶多酚后，與NP對照組相比，茶多酚為0.7-7μg·kg-1時不能顯著緩解NP對蚯蚓生長的抑制，但是茶多酚為70～700μg·kg-1時能顯著緩解NP對蚯蚓生長的抑制。

2.3.3茶多酚對NP脅迫下蚯蚓體壁損傷的緩解作用

NP對照組中蚯蚓體壁角質層破損明顯，環(huán)肌層薄，小于或接近表皮層厚度（圖5）。各質量濃度茶多酚處理14d后，蚯蚓體壁角質層光滑完整，沒有破損現(xiàn)象發(fā)生，環(huán)肌層厚度有所增加，大于或等于表皮層厚度，與清水對照組相似。

2.4茶多酚對NP脅迫下蚯蚓回避行為的緩解

茶多酚對NP脅迫下蚯蚓回避的保護試驗結果（圖6）表明土壤中添加0.7～7μg·kg-1的茶多酚能明顯緩解蚯蚓的回避反應，7μg·kg-1茶多酚組蚯蚓回避率已為負值，表明蚯蚓對受試物無反應。但是加大茶多酚用量后，蚯蚓的回避率有了小幅上升。

3討論與結論

本試驗發(fā)現(xiàn)，NP對蚯蚓具有致死作用，且致死率隨著NP用量的升高而增加。NP為400mg·kg-1時，受試蚯蚓全部死亡。這與許多化學污染物的毒性試驗結果一致[28]。雖然蚯蚓對土壤中的NP具有蓄積性，但其蓄積具有動態(tài)變化的特征。Jun[29]利用14C追蹤NP在威廉腔環(huán)蚓（Metaphire guillelmi）體中的蓄積，發(fā)現(xiàn)威廉腔環(huán)蚓在NP中暴露20d后，生物.土壤的蓄積因子為1.2，表明NP體內蓄積是蚯蚓急性及亞急性致死的首發(fā)原因。智勇等[30]同樣利用威廉腔環(huán)蚓了解NP異構體在蚯蚓體內蓄積的動態(tài)變化時發(fā)現(xiàn)：威廉腔環(huán)蚓暴露7d時，蚯蚓對NP的蓄積受土壤中NP含量影響不大，7～28d，較高含量結合殘留態(tài)NP在蚯蚓體內形成較快，28～56d結合殘留態(tài)NP在蚯蚓體內持續(xù)累積。這種蓄積高峰的特點在本研究中依然存在，高量組的蚯蚓在第5d才開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但從第7d開始，每天在較低量NP中都有蚯蚓陸續(xù)死亡，死亡率與NP含量呈正比，表明污染土壤中NP在赤子愛勝蚯蚓體內蓄積達致死毒性閾值的作用時間發(fā)生在第5d。

蚯蚓的回避行為已廣泛用于污染土壤生態(tài)的風險評價[24，28-33]。體重變化是非常敏感的指標，可反映污染物對機體生長的影響。本研究結果表明蚯蚓對NP污染的土壤具有回避行為，同時發(fā)現(xiàn)即使在遠低于14dLC50的用量，NP也會造成蚯蚓體重的下調，表現(xiàn)為明顯的生長抑制，表明了NP的脅迫對蚯蚓生態(tài)具有毒性作用，這與部分污染物對蚯蚓生長抑制的研究結果相一致[34]。

蚯蚓的體壁結構的變化是蚯蚓對土壤污染物毒性的早期、直接的反應[35]。本研究表明NP脅迫使蚯蚓體壁增厚、角質層破損甚至脫落、分泌的腺細胞先增多后減少，環(huán)肌層變薄。這與高玉紅[36]在研究阿苯噠唑對蚯蚓皮膚的影響以及李輝龍[37]在1，2，4-三氯苯對蚯蚓表皮影響的研究結果是一致的。這些體壁結構的損傷使得蚯蚓失去了對外界化學污染物的有效抵御，后續(xù)化學污染物通過破損的皮膚直接進入體內作用靶點發(fā)揮毒性功能。有文獻報道，生物體內，有毒物質的代謝將產(chǎn)生大量的活性氧，從而引起機體某些酶活性的改變與失活，當體內抗氧化防御系統(tǒng)不能消除機體產(chǎn)生的活性氧時，可引起機體的氧化應激，從而對機體產(chǎn)生損傷，所以細胞內許多抗氧化酶活性的改變和膜脂質過氧化的損傷被一致認為是許多毒物作用機制之一[34-35]。趙曉祥[38]在對NP脅迫下赤子愛勝蚯蚓體內抗氧化酶酶活的研究中發(fā)現(xiàn)：NP脅迫下，其體內SOD、CAT以及GST都表現(xiàn)為先誘導后抑制下降的變化規(guī)律，表明了生物體在遭受環(huán)境污染初期時抗氧化酶誘導表達激活，但隨著污染物的持續(xù)暴露，抗氧化酶不能轉化更多的毒性物質，最終表現(xiàn)為酶活力下降，從而導致了機體組織細胞的損傷。所以NP通過破損的體壁進人體內，引發(fā)細胞抗氧化能力下降可能是誘發(fā)蚯蚓生態(tài)毒性的原因之一。

茶多酚具有抗氧化性，拮抗重金屬、脂肪酸毒性、神經(jīng)元的氧化毒性等作用。本試驗在NP液中加入茶多酚后發(fā)現(xiàn)蚯蚓的死亡率明顯降低，7～700μg·kg-1質量濃度的茶多酚組中蚯蚓死亡率都為0，全部存活，表明茶多酚對NP所致蚯蚓致死毒性具有緩解作用。此外，加入茶多酚后不僅能改善蚯蚓對NP的回避率，也改善了NP對蚯蚓生長的抑制。對蚯蚓體壁的組織細胞觀察發(fā)現(xiàn)：加入茶多酚后蚯蚓體壁的代償性反應減小了，表現(xiàn)為體壁角質層光滑完整，環(huán)肌層厚度恢復正常。以上結果均表明茶多酚可通過保護蚯蚓的體壁而加強對NP的抵御能力，減緩或減弱NP對蚯蚓體內細胞的損害，從而緩解NP對蚯蚓所致的生態(tài)毒性作用。然而，茶多酚只在適當?shù)馁|量濃度范圍內才具有抗氧化作用，且對飼喂的動物無明顯致死與生長抑制毒性;當超劑量使用時，清除自由基能力下降，毒副作用加強[39]。雖然高量的茶多酚不會對生殖細胞及遺傳造成損傷，但能引起動物的急性死亡，所以對試驗動物的致死作用是高質量濃度茶多酚最明顯的毒副作用[40]。本研究結果也表明一定含量范圍內的茶多酚具有緩解作用。

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（責任編輯：張梅）

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收稿日期：2020-04-08初稿;2020-07-14修改稿

作者簡介：陳建華（1973-），女，博士，講師，研究方向：遺傳毒理（E-mail： jhchen@fjnu.edu.cn）

*通信作者：王國紅（1967-），女，博士，教授，研究方向：動物生態(tài)（E-mail：guohongw@fjnu.edu.cn）

基金項目：福建省自然科學基金項目（2015J01125）：福建省自然科學基金引導性項目（2015N0027）