王穎 何亞楠 車逸豪 袁仕夢 趙海榮 巫秀美 楊志斌

中圖分類號R969;R541

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0160-05

DOI

10.6039/{.issn.1 001-0408.2020.02.07

摘 要 目的：初步優(yōu)選川芎嗪涂膜劑的制備工藝，并研究其體外經(jīng)皮滲透特性。方法：采用單因素試驗(yàn)，以聚乙烯醇（PVA-124）、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量為因素，采用改良的評分標(biāo)準(zhǔn)對涂膜劑基質(zhì)的成膜時(shí)間、成膜性、延展性、均勻度和有無氣泡等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，優(yōu)選川芎嗪涂膜劑基質(zhì)處方。在優(yōu)選基質(zhì)處方的基礎(chǔ)上制備備不同載藥量川芎嗪（300、250、200、150、100、50 mg/mL）的涂膜劑，并考察其最大載藥量。采用高效液相色譜法測定川芎嗪含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。取離體大鼠背部皮膚，對高、中、低載藥量（100、75、50 mg/mL）川芎嗪涂膜劑進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)，分別于第15、30、45、60、75、90、120、150、180 min時(shí)取樣測定，并計(jì)算川芎嗪的滲透速率。結(jié)果：PVA-124、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量分別為2.5 9、7.0 mL、1.97mL、0.07 mL、0.28 mL（以50 mL處方量計(jì)）時(shí)的川芎嗪涂膜劑基質(zhì)處方為最優(yōu);川芎嗪的最大載藥量為100 mg/mL。川芎嗪含量測定方法的線性范圍為3.125-100 μg/mL，其專屬性、精密度、重復(fù)性、回收率、穩(wěn)定性考察均符合要求（RSD均小于2%）;高、中、低載藥量川芎嗪涂膜劑的滲透速率分別為608.42、384.19、158.20 μg/（cm2.h）。結(jié)論：按優(yōu)選處方制備的川芎嗪涂膜劑成膜時(shí)間短、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，載藥量可達(dá)100 mg/mL;75 mg/mL載藥量的涂膜劑即可達(dá)到川芎嗪有效治療血藥濃度的滲透速率范圍。

關(guān)鍵詞 川芎嗪;涂膜劑;處方優(yōu)化;大鼠;經(jīng)皮滲透試驗(yàn);滲透速率

近年來，我國心腦血管疾病發(fā)病率高且呈上升趨勢，截至2017年我國心腦血管病患者人數(shù)已達(dá)到2.9億，多數(shù)患者需長期服藥[1-2]。中醫(yī)藥在臨床用于心腦血管疾病的治療已有較多實(shí)踐及報(bào)道，開發(fā)中藥成分類心腦血管疾病治療的新型制劑具有重要意義。川芎嗪，又名四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TMPZ），是從中藥川芎中提取的一種活性生物堿，具有活血化淤的功能[3]，是治療心腦血管疾病的有效成分[4]。已上市的川芎嗪制劑主要包括口服制劑和注射劑等，但易引起胃部不適及累積性中毒等不良反應(yīng)[5]。為改善上述問題，國內(nèi)外研究者研制開發(fā)了川芎嗪的體外透皮吸收劑型，如貼劑、凝膠劑和軟膏劑等外用制劑，并取得了一定進(jìn)展[6-8]，但尚未見到有關(guān)川芎嗪涂膜劑的制備及對其透皮吸收規(guī)律的研究。涂膜劑是將藥物溶解或分散于含成膜材料的溶劑中，涂抹后可逐漸釋放藥物從而起治療作用的一種新型外用劑型，具有無首關(guān)效應(yīng)、生物半衰期長、藥物毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，并可提高患者服藥依從性[9-12]?；诖耍狙芯繑M制備一種川芎嗪涂膜劑并優(yōu)選其制備方法，同時(shí)研究其透皮吸收特性，旨在為該劑型的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

TPY-2型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）;BSA124S型微量電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];TCL-16M型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）;DHG-9240型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;1260Infrnity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;SK8200H型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）;DZG-303A型超純水機(jī)（上海艾柯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

川芎嗪原料藥（深圳市麗晶生化科技有限公司，批號：11032-118，純度：≥99%）;川芎嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110817-201608，純度：≥98%）;0.9%氯化鈉注射液（昆明南疆制藥有限公司，批號：C150120L;作為生理鹽水使用）;薇婷脫毛膏[利潔時(shí)家化（中國）有限公司，批號：J20140017];乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限責(zé)任公司，批號：17115012，色譜純）;聚乙烯醇124（PVA-124，西隴化工股份有限公司，批號：151024）;無水乙醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20161008）;甘油（浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司，批號：20141230）;吐溫80（上海索萊寶生物科技有限公司，批號：626N047）;氮酮（湖北科捷制藥有限公司，批號：161201）;乙腈（北京百靈威科技有限責(zé)任公司，批號：17115012，色譜純）;其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

健康成年SD大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量180～220g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。大鼠在大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1～2周后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：清潔級，室溫16～22℃，相對濕度70%，12 h明暗交替照明，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物處置方法均符合中國倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎嗪涂膜劑制備方法的優(yōu)化

2.1.1 涂膜劑基質(zhì)的制備參照文獻(xiàn)方法[13]，按處方量稱取成膜材料PVA-124適量，加水密封浸潤24 h，于90℃水浴下溶脹至凝膠狀，取出放涼;邊攪拌邊向PVA-124凝膠溶液中依次加入處方量的無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮，攪拌使之分散均勻，最后加水至足量，得黏稠狀涂膜劑基質(zhì)。

2.1.2 涂膜劑基質(zhì)的評價(jià)方法取“2.1.1”項(xiàng)下涂膜劑基質(zhì)1 mL均勻涂抹于3 cmx3 cm的玻璃板上，以成膜時(shí)間、成膜性、延展性、均勻度以及有無氣泡等作為指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)[14]，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。由于成膜時(shí)間（a）和成膜性（b）是評價(jià)涂膜劑的重要指標(biāo)，故設(shè)定其權(quán)重為0.3;延展性（c）、均勻度（d）、有無氣泡（e）均由直接觀察得到，存在一定主觀性，故設(shè)定其權(quán)重為0.2。按公式計(jì)算綜合評分（y）：y=0.3×（a+b）+0.2×（c+d+e）。

2.1.3 單因素試驗(yàn)優(yōu)化基質(zhì)處方根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)考察結(jié)果，對基質(zhì)影響最大的5個(gè)因素分別為PVA-124用量（A）、無水乙醇用量（B）、甘油用量（C）、吐溫80用量（D）和氮酮用量（E）。對上述因素分別進(jìn)行考察及處方優(yōu)化：（I）PVA-124用量：在基質(zhì)處方的其他成分基本不變的情況下，設(shè)置PVA-124用量分別為1.5、2.0、2.5、3.0g（基質(zhì)處方量均以50 mL計(jì)，以下同）;（2）無水乙醇用量：在基質(zhì)處方的其他成分基本不變的情況下，設(shè)置無水乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 mL;（3）甘油用量：在基質(zhì)處方的其他成分基本不變的情況下，設(shè)置甘油用量分別為1.77、1.97、2.17、2.37 mL;（4）吐溫80用量：在基質(zhì)處方的其他成分基本不變的情況下，設(shè)置吐溫80用量分別為0.05、0.07、0.09、0.11 mL;（5）氮酮用量：在基質(zhì)處方的其他成分基本不變的情況下，設(shè)置氮酮用量分別為0.26、0.28、0.30、0.32 mL。

根據(jù)上述不同因素水平和“2.1.1”項(xiàng)下方法分別制備涂膜劑基質(zhì)（處方中不足部分以水補(bǔ)足）。對所制備的涂膜劑基質(zhì)樣品采用“2.1.2”項(xiàng)下評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果顯示，PVA-124、無水乙醇、甘油、吐溫80、氮酮的用量分別為2.5 g、7.O mL、1.97 mL、0.07 mL、0.28 mL時(shí)，相應(yīng)的基質(zhì)綜合評分最高，詳見表2。

2.1.4 涂膜劑載藥量的考察在“2.1.3”項(xiàng)下優(yōu)選的基質(zhì)處方基礎(chǔ)上制備含不同載藥量川芎嗪（300、250、200、150、100、50 mg/mL）的涂膜劑，再按“2.1.2”項(xiàng)下的評分標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)選川芎嗪涂膜劑的載藥量。結(jié)果顯示，當(dāng)載藥量≤100 mg/mL時(shí)，所制備的川芎嗪涂膜劑體系分散均勻，成膜完整連續(xù)，易于涂布，成膜時(shí)間在5 min以內(nèi)，且不會(huì)出現(xiàn)藥物析出等現(xiàn)象，故將100 mg/mL設(shè)定為該涂膜劑的最大載藥量。

2.1.5 川芎嗪涂膜劑的制備按基質(zhì)處方工藝和載藥量考察結(jié)果，稱取PVA-124 5.Og，加入水80 mL密封浸潤24 h后，于90℃水浴下溶脹至凝膠狀，取出放涼;邊攪拌邊向PVA-124凝膠溶液中加入川芎嗪10 g，再依次緩慢加入無水乙醇溶液14 mL、甘油4 mL、吐溫80 0.15mL、氮酮0.55 mL，攪拌使之分散均勻，最后加水至100mL，即得黏稠狀的川芎嗪涂膜劑（載藥量100 mg/mL）。同法制備載藥量為75、50 mg/mL的川芎嗪涂膜劑，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 川芎嗪含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry-C18（250 mmx4.6mm，5μm）;流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20min， 5%B→41%B）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35℃;檢測波長：280 nm;進(jìn)樣量：5μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察精密稱取川芎嗪對照品10 mg，加生理鹽水溶解并定容至50 mL，制得200 μg/mL的對照品母液。取上述對照品母液適量，以生理鹽水稀釋制成質(zhì)量濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測，平行操作3次。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.398 9x-2.286 2（r=0.999 9）。結(jié)果表明，川芎嗪質(zhì)量濃度在3.125～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)取未給藥大鼠的背部皮膚，加生理鹽水適量研磨后制成空白皮膚勻漿液后備用;取空白涂膜劑基質(zhì)，加生理鹽水適量稀釋后備用;取體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)3h時(shí)的接收液凍干樣品，加適量生理鹽水溶解后備用;取川芎嗪原料藥，加適量空白皮膚勻漿液溶解后備用;取川芎嗪原料藥，加適量生理鹽水溶解后備用。取上述溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各色譜峰分離良好，無雜質(zhì)峰干擾，表明涂膜劑基質(zhì)和空白皮膚勻漿液對川芎嗪的含量測定無干擾，詳見圖1。

2.2.4 精密度試驗(yàn)取“2.1.5”項(xiàng)下制備的川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL），用生理鹽水稀釋制成低、中、高質(zhì)量濃度（6.25、25、100 μg/mL）的溶液，于同日內(nèi)的3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，按“2.2.1'，項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每個(gè)濃度均重復(fù)測定6次。結(jié)果，川芎嗪峰面積RSD分別為0.49%、0.65%、0.42%（n=6），表明該方法精密度良好。2.2.5重復(fù)性試驗(yàn)取體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時(shí)的取樣液各適量，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，取樣液中川芎嗪含量為24.71 μg/mL，RSD為1.12%（n==6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時(shí)的接收液適量，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果，川芎嗪峰面積RSD為0.61%（n=6）;另取上述樣品接收液適量，于-80℃分別凍融1、2、3、4、5、6次，同法進(jìn)樣測定，結(jié)果，川芎嗪峰面積RSD為1.98%（n=6）。結(jié)果表明，樣品接收液在室溫下放置24h或凍融6次的條件下穩(wěn)定性均較良好。2.2.7加樣回收率試驗(yàn)精密吸取體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)中川芎嗪涂膜劑（載藥量50 mg/mL）在90 min時(shí)的接收液（已知含川芎嗪24.71 μg/mL），共5份，每份1 mL，分別加入“2.2.2”項(xiàng)下25 μg/mL的對照品溶液1 mL，混勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，川芎嗪平均加樣回收率為101.6%，RSD為1.91%（n==5），表明本方法準(zhǔn)確度較好。

2.3 川芎嗪涂膜劑體外經(jīng)皮滲透特性考察

2.3.1 離體鼠皮制備參照文獻(xiàn)方法[16]進(jìn)行離體鼠皮制備。以脫毛膏對大鼠背部皮膚進(jìn)行脫毛處理，次日將大鼠斷頸處死，分離已脫毛的背部皮膚，仔細(xì)剝離皮下脂肪層和結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈并浸泡，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)取“2.3.1”項(xiàng)下制備的離體鼠皮，置于藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀的直立式擴(kuò)散池（擴(kuò)散杯面積為2.54 cm2）中，角質(zhì)層面向供給室，真皮層面向接收室。使皮膚與擴(kuò)散液（生理鹽水7 mL）結(jié)合緊密、無氣泡，設(shè)置溫度為（37±0.5）℃、接收池?cái)嚢枳愚D(zhuǎn)速為300 r/min[l6]。試驗(yàn)設(shè)置川芎嗪涂膜劑高、中、低劑量組，于離體表皮層皮膚涂抹“2.1.5”項(xiàng)下制備的高、中、低載藥量（100、75、50 mg/mL）的川芎嗪涂膜劑各300 μL，進(jìn)行經(jīng)皮滲透試驗(yàn)，平行測定3次。分別于第15、30、45、60、75、90、120、150、180 min時(shí)吸取接收液樣品各1 mL，同時(shí)補(bǔ)加等容等溫的新鮮擴(kuò)散液。取樣液于-80℃冷凍保存，室溫解凍后備測。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)取“2.3.2”項(xiàng)下各時(shí)間點(diǎn)的取樣液，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法測定川芎嗪含量，并按照以下公式計(jì)算川芎嗪的單位面積累積滲透量（Qn）[17]：Qn=（

）/A0式中，A為有效經(jīng)皮吸收面積（2.54cm2），V為擴(kuò)散液總體積（7 mL），K為取樣液體積（1mL），Cn為第n次取樣時(shí)樣品接收液中的藥物濃度，Ci為第i次（i≤n-l）取樣時(shí)接收液中的藥物濃度。以Qn為縱坐標(biāo)、時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)作經(jīng)皮滲透曲線圖，并在O～180 min的時(shí)間范圍內(nèi)以Qn對t進(jìn)行線性回歸，所得斜率即為藥物的滲透速率（J）。

對3種不同載藥量的川芎嗪涂膜劑的經(jīng)皮滲透曲線進(jìn)行比較（如圖2所示），結(jié)果顯示，高、中、低載藥量的川芎嗪涂膜劑的J值分別為608.42、384.19、158.20μg/（cm2·h）。這表明在載藥量50～100 mg/mL的范圍內(nèi)，川芎嗪體外滲透速率隨載藥量的增加而增大。

3 討論

在藥物透皮吸收研究中，實(shí)驗(yàn)用離體皮膚的性質(zhì)及狀態(tài)對藥物的經(jīng)皮滲透行為影響較大。最理想的皮膚材料是利用人體皮膚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，但人體皮膚難以獲得。因此，基于與人體皮膚接近程度及可及性考慮[18-19]，本試驗(yàn)選擇大鼠皮膚為模型進(jìn)行制劑的經(jīng)皮滲透特性研究。

涂膜劑制備工藝的好壞直接影響到涂膜劑的穩(wěn)定性及其質(zhì)量。除成膜時(shí)間為量化指標(biāo)外，成膜性、均勻度等性能均是依靠主觀來定性評價(jià)，因此本課題組對傳統(tǒng)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了改良，將成膜時(shí)間、成膜性等分別量化計(jì)分，并作為評價(jià)涂膜劑的重要指標(biāo)，設(shè)定其權(quán)重為0.3;而對于存在一定主觀性的延展性、均勻度、有無氣泡等觀察指標(biāo)，則將權(quán)重設(shè)定為0.2，提高了該涂膜劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察初步探索了川芎嗪涂膜劑的處方，后續(xù)將進(jìn)一步通過正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面法等對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。現(xiàn)工藝中涂膜劑的最大載藥量為100 mg/mL。本研究分別考察了高、中、低（100、75、50mg/mL）3種載藥量川芎嗪涂膜劑的體外透皮特性，結(jié)果顯示，在透皮擴(kuò)散面積為2.54 cm2的情況下，75 mg/mL載藥量的涂膜劑滲透速率為384.19 μg/（cm2.h），已達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的川芎嗪有效治療血藥濃度的滲透速率范圍即157.17～488.085 μg/（cm2.h）[20]，可作為后續(xù)川芎嗪涂膜劑有效載藥量進(jìn)一步優(yōu)化篩選的參考依據(jù)。

綜上，本研究設(shè)計(jì)并制備了川芎嗪涂膜劑并初步考察了其體外釋放特性，其制備工藝簡便，所得75 mg/mL載藥量的涂膜劑的體外滲透速率可達(dá)到川芎嗪有效血藥濃度的滲透速率范圍。但體外試驗(yàn)結(jié)果無法完全反映體內(nèi)生物環(huán)境的影響，因此后續(xù)需進(jìn)一步評價(jià)川芎嗪涂膜劑的體內(nèi)有效性和安全性，并進(jìn)行質(zhì)量研究，以期為該制劑的開發(fā)和應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-07-02 修回日期：2019-12-08）

（編輯：段思怡）

△基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ No.81703742）;云南省科技計(jì)劃青年項(xiàng)目（No.2016FD074）;國家地方聯(lián)合工程研究中心創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目（No.云發(fā)改高技[2015]395）;云南省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)計(jì)戈0項(xiàng)目（No.2015DG030）

*碩士研究生。研究方向：藥物新劑型。電話：0872-2214251。E-mail： wy15754632309@126.com

# 通信作者：助理研究員，博士研究生。研究方向：藥物新劑型。電話：0872-22142510 E-mail： 79204431@163.com