胡 揚，薛 昊，王金宏，王 昊，徐蓓蕾，孫麗鵬，楊 波

(哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱150076)

槐定堿(Sophoridine, SR)是從豆科槐屬植物苦豆子、山豆根中得到四環(huán)類喹諾里西啶類生物堿[1]，是由我國科研人員自主研發(fā)的一種新型廣譜抗癌藥[2]，可以抑制多種動物移植的腫瘤[3-5]，對人類白血病細胞株、表皮癌株也有一定的抑制作用.

隨著研究的不斷深入，槐定堿更多的藥理作用陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，新技術和新劑型的研究也相應增加.目前已上市的僅有鹽酸槐定堿注射液，作為廣譜抗癌藥，具有一定副作用，并且臨床試驗表明該藥在人體內分布廣，半衰期短，消除較快.因此如何將槐定堿制成緩釋制劑給藥，既能提高槐定堿在體內的靶向分布，延長半衰期，又可避免原注射劑對人體所引起的副作用，已成為研究人員關注的重點.

課題組前期實驗完成了槐定堿微球體外分析方法的建立.本文通過單因素考察實驗和正交實驗確定了槐定堿微球的處方和制備工藝，以期待在后續(xù)研究中利用微球的靶向性和緩釋性能，對特定的器官進行靶向治療.

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

槐定堿(質量分數(shù)>98%，西安天瑞生物技術有限公司)；槐定堿對照品(質量分數(shù)>98%，上海源葉生物科技有限公司)；殼聚糖(脫乙酰度≥95%，黏度100～200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

司盤80(分析純，天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠)；吐溫80(分析純，天津市光復精細化工研究所)；戊二醛50%(分析純，天津市瑞金特化學品有限公司)；異丙醇(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；三乙胺(分析純，天津市光復精細化工研究所)；甲醇(色譜純，默克股份兩合公司，德國)；乙腈(色譜純，默克股份兩合公司，德國).

1.2 儀器

Waters 1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)；UV-5200PC紫外/可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；AXTGL18M安信離心機(鹽城市安信實驗儀器有限公司)；LE204E102電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；FE28型pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)

2 實驗方法

2.1 制備方法

通過查閱文獻[6-11]和預試驗結果，確定微球的制備方法為乳化交聯(lián)法，制備工藝如下：精密量取一定量的液體石蠟、乳化劑司盤-80置于燒杯中，作為油相用磁力攪拌器混合均勻.另稱取殼聚糖置于燒杯中，用稀釋的醋酸溶解后，靜置脫氣，取槐定堿原料藥溶于水中，與殼聚糖溶液混合，用磁力攪拌器將其混合均勻，作為水相.磁力攪拌器升溫至一定溫度后，將水相緩慢滴入油相內，乳化，一段時間后加入戊二醛進行固化，繼續(xù)攪拌直至微球形成.靜置，將上清液倒出，用石油醚和丙酮洗滌、抽濾，將上清液和洗滌液合并得到合并液，洗滌后部分干燥得到微球.

2.2 槐定堿微球體外分析方法

采用Waters1525高效液相色譜儀進行槐定堿含量測定.色譜條件如下：色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鉀(含0.2 mL/L三乙胺)溶液-乙腈(90∶10)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：208 nm.

2.3 包封率和載藥量的測定

精密量取一定量的微球，研磨，加入適量甲醇，震蕩搖勻，定容，超聲60 min，渦旋1 min.12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，進樣10 μL測定峰面積，計算樣品中含槐定堿的量，按公式算出微球的載藥量和包封率.

2.4 單因素篩選實驗

1)殼聚糖用量的選擇

按照“2.1項”下方法，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，油水比例為3∶1，交聯(lián)時間3 h，藥物用量0.04 g，其他條件均相同，考察不同用量的殼聚糖對微球的影響.

2)固化溫度的選擇

按照“2.1項”下方法，油水比3∶1，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，殼聚糖用量0.05 g，藥物用量0.04 g，交聯(lián)時間3 h，其他條件均相同，考察固化溫度對微球的影響.

3)油水比例的選擇

按照“2.1項”下方法，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，殼聚糖用量0.05 g，藥物用量0.04 g，交聯(lián)時間3 h，其他條件均相同，考察油水比對微球的影響.

4)交聯(lián)劑用量的選擇

按照“2.1項”下方法，油水比3∶1，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，藥物用量0.04 g，殼聚糖用量0.05 g，交聯(lián)時間3 h，其他條件均相同，考察交聯(lián)劑用量對微球的影響.

5)交聯(lián)劑固化時間的選擇

按照“2.1項”下方法，油水比3∶1，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，殼聚糖用量0.05 g，藥物用量0.04 g，其他條件均相同，考察交聯(lián)時間對微球的影響.

6)藥物用量的選澤

按照“2.1項”下方法，油水比3∶1，乳化劑為司盤-80，用量為0.54 g，殼聚糖用量0.05 g，交聯(lián)時間3 h，其他條件均相同，考察槐定堿用量對微球的影響.

7)乳化劑用量的選擇

按照“2.1項”下方法，油水比3∶1，殼聚糖用量0.05 g，交聯(lián)時間3 h，藥物用量0.04 g，其他條件均相同，考察藥物乳化劑司盤-80用量對微球的影響.

2.5 正交設計優(yōu)化制備工藝

在預實驗以及單因素考察實驗結果的基礎上，選擇交聯(lián)時間(A)、乳化劑用量(B)、殼聚糖用量(C)為三個因素，以槐定堿微球的載藥量、包封率和粒徑為指標，按照 L9(34)表進行正交實驗.

2.6 驗證實驗

采用最終確定的制備工藝制備3批槐定堿微球，進行平行實驗驗證.

3 實驗結果與分析

3.1 單因素篩選實驗結果

1)殼聚糖用量的選擇

結果見表1，選擇殼聚糖用量為75 mg.

表1 殼聚糖用量的篩選結果(n=3)

2)固化溫度的選擇

結果見表2，選擇固化溫度為40 ℃.

表2 溫度的篩選結果(n=3)

3)油水比例的選擇

結果見表3，選擇水油比為1∶3.

表3 水油比例的篩選結果(n=3)

4)交聯(lián)劑用量的選擇

結果見表4，選擇交聯(lián)劑的用量為0.3 mL.

表4 交聯(lián)劑用量的篩選結果(n=3)

5)交聯(lián)劑固化時間的選擇

結果見表5，選擇交聯(lián)時間為3 h.

表5 交聯(lián)時間的篩選結果(n=3)

6)藥物用量的選擇

結果見表6，選擇槐定堿用量為40 mg.

表6 槐定堿用量的篩選結果(n=3)

7)乳化劑用量的選擇

結果見表7，選擇乳化劑用量為0.63 g.

表7 乳化劑用量的篩選結果(n=3)

3.2 正交設計實驗結果

因素和水平見表8，實驗結果見表9～12.

表8 正交設計因素水平表

表9 L9(34)正交設計表

表10 載藥量方差分析表

表11 包封率方差分析表

表12 粒徑方差分析表

結合表9、10結果，對R進行比較得到三種因素對槐定堿微球載藥量的影響順序為C>A>B，從載藥量方差結果可知，因素A、B對殼聚糖微球無顯著性(P>0.05)，C因素有顯著影響性(P<0.05)，綜合考慮，此時的最佳工藝為A3B2C1.

結合表9和表11結果，對R進行比較得到三種因素對槐定堿微球包封率的影響順序為C>A>B，從包封率方差結果可知因素A、C對殼聚糖微球具有顯著性(P<0.05)，B因素無顯著影響性(P>0.05)，綜合考慮，此時的最佳工藝為A3B2C1.

結合表9和表12結果，對R進行比較得到三種因素對微球粒徑的影響順序為C>A>B，從粒徑方差結果可知因素C對殼聚糖微球粒徑具有顯著性(P<0.05)，因此當殼聚糖用量為50 mg時，粒徑偏小，再結合包封率和載藥量結果，綜合考慮，最佳工藝為A3B2C1.

正交實驗結果表明槐定堿微球的制備工藝為A3B2C1，即交聯(lián)時間為3.5 h、乳化劑用量0.63 g、殼聚糖用量50 mg.

綜上，槐定堿微球的制備工藝為：50 mg殼聚糖溶于稀釋的醋酸水溶液中，攪拌混勻作為水相.司盤-80 0.63 g置于燒杯中，于40 ℃中攪拌均勻作為油相，將40 mg槐定堿溶解放入水相中，混勻后逐滴放入油相中，乳化30 min，加交聯(lián)劑戊二醛0.3 mL，交聯(lián)時間3.5 h，靜止沉淀，棄上清液，用石油醚洗滌下層微球后干燥，即得槐定堿微球.

3.3 驗證實驗結果

按最終確定的制備工藝平行制備3組槐定堿微球，對載藥量和包封率進行測量，用顯微計數(shù)法計算粒徑，結果見表13.結果表明，此方法重現(xiàn)性好.

表13 最優(yōu)處方驗證結果(n=3)

4 結 語

本實驗選擇生物相容性好、可降解型高分子材料作為載體將槐定堿制成槐定堿微球[12-14]，利用殼聚糖本身具有的生物活性，增加對器官的靶向性[15]，減少槐定堿對其他器官的毒性，可使藥物在給藥后到達靶器官緩慢持續(xù)釋放，延長槐定堿在體內的半衰期，與注射液相比較能夠減少用藥周期，為槐定堿的給藥提供可靠的緩釋劑型，為中藥有效成分的靶向緩釋制劑的開發(fā)應用提供依據.