劉艷玲，向鳳寧

(1.德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023；2.山東大學(xué)生命科學(xué)院植物細(xì)胞工程與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山東 青島 266237)

【研究意義】通過克隆植物代謝通路上某一關(guān)鍵酶基因并對其蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析可為該代謝途徑的調(diào)控機理提供一定的理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】狹葉柴胡(Bupleurumscorzonerifolium)系傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(Bupleurum)多年生草本植物，主要分布于我國東北、華北、西北、江蘇、四川等地[1-2]。《中國藥典》2015年版中規(guī)定狹葉柴胡的干燥根為藥材柴胡[3]，主要成分為柴胡皂甙、甾醇、揮發(fā)油和多糖，其中柴胡皂甙類化合物含量較高，柴胡皂苷d (SSd) 的藥理活性最強[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明狹葉柴胡具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等功效[5-6]，已廣泛應(yīng)用于腎病、肝纖維化、腫瘤等疾病的治療，并取得了顯著療效，其中尤以保肝作用效果最佳，這也與傳統(tǒng)中醫(yī)記載柴胡疏肝解郁功效一致[7]。柴胡皂甙d結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜齊墩果烷型，β-amyrin 合成酶是齊墩果酸合成的關(guān)鍵酶之一，屬于氧化角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)家族[8-10]。目前已從人參[11]、豌豆[12]、甘草[13]、白樺[14]、擬南芥[15]等多種植物中成功克隆得到編碼β-amyrin合成酶的cDNA序列，但尚未見狹葉柴胡 β-amyrin合成酶基因克隆及其生物信息學(xué)分析的報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究中，首先克隆獲得狹葉柴胡 β-amyrin 合成酶基因的全長序列，然后采用生物信息學(xué)方法，對該基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化特性、空間結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測和分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】有望為齊墩果烷型代謝產(chǎn)物及代謝途徑的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料狹葉柴胡采自內(nèi)蒙古。

1.2 試劑

DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、Olig(dT)12-18、5×M-MLV reverse transcriptase Buffer、10 mM each dNTPs、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNaseI(4 U/μl)、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、Solution I、pMD18-T載體等購自TaKaRa公司；TRIZOL、DEPC、瓊脂糖、LB培養(yǎng)基等購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 BsAS全長序列擴增 (1) BsAS基因中間片段的擴增。正向引物 P1: 5’-TGGCTTTCGATA(T)CTTGGA-3’;反向引物 P2：5′-CCACCG(A)TTTTTG(A)CTCTGTA-3’。

(2)BsAS基因5’端片段的擴增。采用20 μl PCR體系，首先P3與P4進(jìn)行擴增，將PCR產(chǎn)物取0.2 μl為模板進(jìn)行P4與P6的擴增，再將二次PCR產(chǎn)物取0.2 μl為模板進(jìn)行P5與P6的擴增。

5′半套式PCR反向引物。P3: 5′-TGACGGCGTCATACATTTTC-3′；P4: 5′-CTCAACCCAACAAGCAA GC-3′；P5: 5′-TTTCATCTTCATAATGTATATG-3′。正向引物。P6: 5′-ATGTGGARGCTDAAGATHG-3′。

(3)BsAS基因3’端片段的擴增。采用3’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法進(jìn)行擴增，參照Clonetech, SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南進(jìn)行。正向引物為P7：TCTTACTATCATTACAGAGCA；反向引物為3’RACE試劑盒中自帶。

(4)BsAS全長基因的擴增。正向引物P8：5′-ATCCGAAAGGAGACTATTTCA AG-3′；正向引物P9：5′- TTAAAGAGTAGTGGAAGGCA A-3′；擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min， 60 ℃ 2.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

以上引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測序由博尚生物公司完成，核苷酸及蛋白質(zhì)序列比對分析利用DNAMAN軟件中的比對程序進(jìn)行。

1.3.2 BsAS序列生物信息學(xué)分析 使用ExPASy的ProParam在線數(shù)據(jù)庫對狹葉柴胡BsAS序列進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測分析；應(yīng)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具對狹葉柴胡BsAS序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析；利用PSORT Ⅱ軟件對狹葉柴胡BsAS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用Conserved Domains Search 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)對狹葉柴胡BsAS氨基酸進(jìn)行保守域分析；采用 SOPMA 在線工具預(yù)測狹葉柴胡BsAS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；使用Swi-ssModel 網(wǎng)站(https://www.swissmodel.expasy.org/)中的在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建狹葉柴胡BsAS 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用NetPhos3.1 server在線軟件對狹葉柴胡BsAS序列的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測應(yīng)用MEGA6.0對狹葉柴胡進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 狹葉柴胡中β-amyrin合成酶基因BsAS的克隆

首先從Genebank中下載甘草、豌豆、人參、白樺的β-amyrin合成酶基因序列，設(shè)計簡并引物P1、P2，在狹葉柴胡cDNA中進(jìn)行擴增，獲得約900 bp的一條片段，經(jīng)測序、序列比對確定為β-amyrin合成酶基因片段。然后5’片段使用半套式PCR方法，3’片段使用RACE方法進(jìn)行擴增，最后通過引物P8和P9進(jìn)行基因全長的克隆(圖1)，經(jīng)BLAST分析，結(jié)果表明，該基因編碼β-amyrin合成酶，全長2289 bp，共編碼762 aa，命名為BsAS(β-amyrin synthase gene)。BsAS的核苷酸及氨基酸序列見圖2。

1:中間片段擴增，2:5’片段擴增，3: 3’片段擴增，BsAS:全長cDNA擴增1: Intermediate fragment amplification，2: 5’fragment amplification，3: 3’fragment amplification，BsAS:Full-length cDNA amplification

圖2 BsAs核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Sequence of BsAs nucletide and aiminoacids

2.2 狹葉柴胡BsAS基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 BsAS保守序列分析 研究表明，氧化鯊烯環(huán)化酶家族蛋白具有高度保守的DCTAE、QW和MWCYCR 3個序列。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)BsAS中含有4個拷貝的QW序列、1個DCTAE序列和1個MWCYCR序列(圖3)。

a.QW閱讀框架；b.PCTAE閱讀框架；c.MWCYCR閱讀框架

利用Conserved Domains Search 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)對狹葉柴胡BsAS氨基酸進(jìn)行保守域分析，發(fā)現(xiàn)狹葉柴胡BsAS序列的1～758 位氨基酸是它的功能區(qū)域，注釋為Camelliol C合酶，該酶屬于氧化鯊烯環(huán)化酶家族 (圖4)。

圖4 狹葉柴胡BsAS氨基酸保守區(qū)分析Fig.4 Conserved domain prediction of B. scoronerifolium BsAS amino acid

2.2.2 狹葉柴胡BsAS理化性質(zhì)分析 使用ExPASy的ProParam在線數(shù)據(jù)庫對狹葉柴胡BsAS序列進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測分析。推測BsAS序列的分子式為C3955H5944N1046O1112S48，分子量為87.47592 kDa， pI為6.04，帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)為90，帶正電殘基(Arg + Lys) 為75，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為50.25，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為74.79，BsAS蛋白的親水性平均系數(shù)為-0.357，為親水性蛋白。

使用 ExPASy 的在線分析工具 Protscale 對狹葉柴胡BsAS 蛋白的親疏水性做進(jìn)一步預(yù)測(圖5)，結(jié)果表明：狹葉柴胡BsAS氨基酸多肽鏈的親水性最小值為-2.811，最大值為2.644；BsAS中親水性氨基酸所占比例較大，疏水性氨基酸所占比例較小，其結(jié)果與ProParam軟件預(yù)測相一致。

圖5 狹葉柴胡BsAS的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of B. scorzonerifolium BsAS

2.2.3 狹葉柴胡BsAS跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位分析 應(yīng)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具對狹葉柴胡BsAS序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析，結(jié)果顯示該蛋白沒有跨膜螺旋區(qū)(圖6)。

圖6 狹葉柴胡BsAS序列跨膜區(qū)域預(yù)測Fig.6 Transmembrane domain prediction of B. scorzonerifolium BsAS

利用PSORT Ⅱ軟件對狹葉柴胡BsAS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)狹葉柴胡BsAS蛋白有39.1 %位于細(xì)胞質(zhì)中，26.1 %位于線粒體上，17.4 %位于細(xì)胞核內(nèi)，4.3 %位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，4.3 %位于分泌系統(tǒng)的囊泡中，4.3 %位于過氧化體，其余4.3 %位于高爾基體，表明狹葉柴胡BsAS蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.4 狹葉柴胡BsAS二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用SOPMA在線工具預(yù)測狹葉柴胡BsAS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(圖7)，狹葉柴胡BsAS蛋白二級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列中α-螺旋(Hh)為45.14 %，β-轉(zhuǎn)角(Tt)為7.35 %，無規(guī)卷曲(Cc)為 34.38 %，延伸鏈(Ee)為13.12 %。從組成數(shù)據(jù)可以看出，該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角只在局部出現(xiàn)。

圖7 狹葉柴胡BsAS二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Prediction of secondary structure of B. scoronerifolium BsAS

2.2.5 狹葉柴胡BsAS三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用Swi-ssModel 網(wǎng)站(https://www.swissmodel.expasy.org/)中的在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建狹葉柴胡BsAS 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖8)，該模型的全球性模型質(zhì)量估測(global model quality estimation, GMQE)得分為0.71，在0～1之間，較接近1，由此確定狹葉柴胡BsAS三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果可靠。

圖8 狹葉柴胡BsAS三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of tertiary structure of B. scoronerifolium BsAS

2.2.6 狹葉柴胡BsAS磷酸化位點預(yù)測 應(yīng)用NetPhos3.1 server在線軟件對狹葉柴胡BsAS序列的磷酸化位點進(jìn)行預(yù)測(圖9，表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列有多個磷酸化位點，但僅有23個絲氨酸、14個蘇氨酸、16 個酪氨酸的磷酸化能力超過了閾值，表明狹葉柴胡BsAS只有53個磷酸化位點。其主要的磷酸化位點是蛋白激酶C(PKC)位點、酪蛋白激酶П(CKП)位點和細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴性激酶(cdc2)位點。

表1 狹葉柴胡BsAS 磷酸化位點列表

圖9 狹葉柴胡BsAS磷酸化位點預(yù)測Fig.9 Phosphorylation sites prediction of B. scoronerifolium BsAS

3 討 論

通過對BsAS基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有氧化鯊烯家族特有的3個保守基序DCTAE、QW和MWCYCR。序列DCTAE與底物結(jié)合有關(guān)；QW序列帶負(fù)電荷，在 2，3-氧化鯊烯的環(huán)化過程中作用于正電荷中間體，達(dá)到穩(wěn)固蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；MWCRCY 序列中的色氨酸(W)參與調(diào)控三萜化合物碳骨架的生物合成。

通過生物信息在線工具預(yù)測狹葉柴胡BsAS 蛋白是親水蛋白，無跨膜螺旋區(qū)，主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，20世紀(jì)50年代以來一直被生物學(xué)家看作是一種動態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程。狹葉柴胡BsAS蛋白質(zhì)含有 53個磷酸化位點，其中最多的磷酸位點是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶C(PKC)。在過去30多年間，PKC家族已被廣泛研究，一致認(rèn)為PKC與多種細(xì)胞過程有關(guān)，包括腫瘤的形成。研究表明，PKC與腫瘤產(chǎn)生的佛波醇酯相關(guān)，其受體會結(jié)合并激活PKC，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長加速。因此，醫(yī)學(xué)上一直將PKC作為抑制腫瘤的靶目標(biāo)[16]。直到2015年，Antal推翻了該理論，認(rèn)為PKC不但不會產(chǎn)生腫瘤，反而會抑制腫瘤的生長。他首先在結(jié)腸癌細(xì)胞的基因組中校正了一個功能缺失的PKC突變，然后發(fā)現(xiàn)該PKC能抑制小鼠腫瘤的生長，而當(dāng)PKC失效時，致癌信號增加，腫瘤生長加速，但長期反復(fù)處理細(xì)胞，PKC長期高表達(dá)，則可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的反饋抑制效應(yīng)，導(dǎo)致PKC的突變或降解，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[17]。本研究中，狹葉柴胡BsAS蛋白的PKC磷酸化位點較多，可通過磷酸化激活PKC的活性，從而抑制腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展，這也與柴胡具有抗腫瘤的性質(zhì)相一致。

4 結(jié) 論

本研究通過基因克隆獲得了長度2289 bp的β-amyrin合成酶基因，其蛋白命名為BsAS，含有氧化鯊烯環(huán)化酶家族所特有的高度保守的DCTAE、QW和MWCYCR開放閱讀框架；BsAS無跨膜區(qū)，為親水性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中；其二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和無規(guī)卷曲，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果可信；共有 53個磷酸化位點，以絲氨酸磷酸化位點最多。BsAS全長基因的克隆和序列分析為狹葉柴胡BsAS基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供了基礎(chǔ)，并可為研究狹葉柴胡三萜合成通路的調(diào)節(jié)方式提供新的認(rèn)識。