劉 郁，耿加敏，段紹斌

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000)

隨著我國(guó)人民群眾飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈不斷升高趨勢(shì)[1]，已成為威脅我國(guó)人群健康的主要腫瘤。由于該病起病較為隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者臨床確診時(shí)已處于進(jìn)展期，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)，雖然現(xiàn)有的診療手段不斷提高，但患者總體預(yù)后不佳，5年生存率較低[2]。有研究指出[3]，結(jié)直腸癌發(fā)病是一個(gè)涉及眾多因素、眾多步驟的復(fù)雜過程，深入探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)該病早期診斷及治療具有重要意義。長(zhǎng)編鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)作為近年來(lái)腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中的一個(gè)重要方向，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。LncRNA-被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活(LncRNA-activated by transforming growth factor-β，LncRNA-ATB)作為首個(gè)發(fā)現(xiàn)的可被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活的LncRNA，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，且與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]，有研究指出[6]，LncRNA-ATB是原發(fā)性肝癌新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中LncRNA-ATB表達(dá)，分析其在不同臨床病理指標(biāo)間的表達(dá)差異性，探討其與患者預(yù)后的相關(guān)性，以期為結(jié)直腸癌機(jī)制研究提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1臨床資料 選取2012年4月至2014年4月在我院行手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未行放化療，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)直腸癌；②臨床資料完整，且均能完成院外隨訪。共117例，其中，男性64例，女性53例，年齡32-78歲，平均年齡(56.82±10.63)歲，腫瘤部位：結(jié)腸62例，直腸55例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期18例，Ⅱ期45例，Ⅲ期54例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。術(shù)中留取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)，用預(yù)冷鹽酸緩沖液(PBS)沖洗干凈后，凍存于-80℃冰箱。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

1.1.2主要試劑和設(shè)備 總RNA提取試劑(Trizol法)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物序列由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，島津2450型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自江蘇萬(wàn)科科教儀器有限公司，LightCycler 480熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中LncRNA-ATB表達(dá) 取結(jié)直腸癌和癌旁組織，剪碎后，研磨，加入細(xì)胞裂解液。利用總RNA提取試劑(Trizol法)提取組織中總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，以A206/A208在1.80-2.20為合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用熒光定量PCR儀按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明擴(kuò)增引物。LncRNA-ATB序列：上游：5’-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3’，下游：5’-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3’；β-actin序列：上游：5’-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3’，下游：5’-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3’。PCR條件：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)45次，每個(gè)樣品設(shè)復(fù)孔6個(gè)。采用2-△△Ct法計(jì)算組織中LncRNA-ATB表達(dá)量。

1.2.2病例隨訪 所有患者于院后隨訪，隨訪形式包括門診復(fù)查、電話短信、住院病歷搜集等，隨訪開始時(shí)間為術(shù)后第1天，截止日期為2019年4月30日。以死亡為終點(diǎn)事件，記錄患者總生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中LncRNA-ATB表達(dá)

LncRNA-ATB在結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量為(2.26±0.20)，高于癌旁組織的(1.00±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=57.756，P<0.001)。

2.2 LncRNA-ATB在不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者組織中表達(dá)

LncRNA-ATB在不同性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位的結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)；LncRNA-ATB在浸潤(rùn)深度漿膜及漿膜外、低分化、TNM分期Ⅲ期、發(fā)生脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量高于浸潤(rùn)深度漿膜下、中高分化、TNM分期Ⅰ-Ⅱ期、未發(fā)生脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 LncRNA-ATB在不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者組織中表達(dá)

2.3 LncRNA-ATB表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響

患者隨訪時(shí)間7-84個(gè)月，中位隨訪時(shí)間35.0個(gè)月。以LncRNA-ATB表達(dá)量的P25值為界值，將患者分為低表達(dá)組(n=32)和高表達(dá)組(n=85)，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間(62.84±5.58)個(gè)月，累積生存率68.75%，分別高于高表達(dá)組的(41.18±3.27)和32.94%，Log-Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.028，P=0.003)，見圖1。

圖1 Kaplan-Meier法分析LncRNA-ATB表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響

2.4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，脈管浸潤(rùn)(HR=2.137，P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.230，P<0.05)和LncRNA-ATB表達(dá)(HR=2.208，P<0.05)均是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，見表2。

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生及進(jìn)展過程復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路異常調(diào)控及眾多基因異常表達(dá)，具體機(jī)制尚未完全清楚。隨著以手術(shù)為主的綜合治療方案的應(yīng)用，多數(shù)結(jié)直腸癌患者生存率及生存質(zhì)量有所提高，但術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[7]，在一定程度上影響了生存時(shí)間，患者總體預(yù)后依然不理想。研究表明[8]，腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是多因素、多階段、涉及眾多基因異常表達(dá)及調(diào)控的復(fù)雜演變過程。因此，積極探討與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感基因?qū)χ笇?dǎo)患者早期診療及改善預(yù)后具有重要意義。LncRNA-ATB屬于LncRNA家族成員，是一種可被TGF-β活化的LncRNA，有研究指出[9]，TGF-β活化LncRNA-ATB可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。亦有研究指出[10]，TGF-β1上調(diào)LncRNA-ATB促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。Xiao等[11]指出，LncRNA-ATB可促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，說(shuō)明結(jié)直腸癌組織中LncRNA-ATB呈高表達(dá)，LncRNA-ATB表達(dá)異?？赡軈⑴c了結(jié)直腸癌發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ATB在浸潤(rùn)深度漿膜及漿膜外、低分化、TNM分期Ⅲ期、發(fā)生脈管浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明LncRNA-ATB可能參與了結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性化進(jìn)展過程。

張立冬等[12]指出，LncRNA-ATB在膀胱癌組織中呈高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)。有研究指出[13]，LncRNA-ATB可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后診斷的標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。亦有研究指出[14]，LncRNA-ATB的高表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間及累積生存率均高于對(duì)照組，說(shuō)明LncRNA-ATB高表達(dá)的患者生存時(shí)間及生存率顯著降低，提示LncRNA-ATB高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，LncRNA-ATB陽(yáng)性表達(dá)是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，進(jìn)一步說(shuō)明LncRNA-ATB表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中LncRNA-ATB呈高表達(dá)，且與患者惡性臨床指標(biāo)及不良預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，有望成為患者靶向治療及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)，但其具體作用機(jī)制，尚待進(jìn)一步開展分子細(xì)胞學(xué)研究予以明確。