張曉琳，劉 穎，竇博鑫，徐晨冉

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076）

大豆分離蛋白（SPI）是一種蛋白質(zhì)含量在90%以上的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，是具有起泡性、乳化性、溶解性、凝膠性等多種功能性質(zhì)的常用食品基料。大豆分離蛋白因其較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值及在食品體系中具有良好功能特性的優(yōu)點，在食品加工領(lǐng)域備受重視[1]。起泡性是蛋白質(zhì)應用于食品加工的一項重要功能性質(zhì)，是影響多糖食品質(zhì)量好壞的關(guān)鍵性因素[2]。許多加工食品，如冰激凌、蛋奶酥、奶油、蛋糕、面包、啤酒等均為泡沫型產(chǎn)品。然而，天然大豆分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定能力并不理想，因此限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應用[3]。通過對大豆蛋白進行改性可以有效提高其起泡性，常用的改性方法有物理、化學及酶法改性，其中酶法改性具有高效性、專一性、多樣性、溫和性和無副產(chǎn)物等優(yōu)點，對食物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)也無破壞作用[4]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase ）是一種由331個氨基組成的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)，可以催化蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián)，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[5]，尤其對蛋白質(zhì)起泡性、乳化性、熱穩(wěn)定性和凝膠性能等改善效果顯著，進而改善食品的口感風味、質(zhì)地外觀等，因此轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在食品加工業(yè)中的應用頗受關(guān)注[6]。

試驗以大豆分離蛋白（SPI）為原料，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase） 在不同條件下對其進行交聯(lián)作用，研究TGase改性對大豆分離蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，并對改性前后粒徑、Zeta電位、游離巰基含量等理化性質(zhì)與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

大豆分離蛋白，臨沂山松生物制品有限公司提供；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（130 U/g），江蘇一鳴生物股份有限公司提供；Ellman試劑，南京杜萊生物技術(shù)有限公司提供。

BS224S型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品；SY-24型恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；202型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；TG16-WS型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Malvern激光粒度儀，上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；722S型分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 TGase交聯(lián)SPI對其起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響

將SPI配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液，調(diào)整pH值后加入一定量的TGase，在指定溫度下交聯(lián)一段時間，交聯(lián)結(jié)束后在80℃下滅酶5 min，獲得交聯(lián)物后取出，烘干備用[7]。分別探討加酶量、pH值、溫度和時間4個因素對TGase改善SPI起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響。

（1）TGase酶量。以SPI溶液為底物，TGase酶量分別為10，20，30，40，50 U/g，在 pH值 7.0，溫度55℃，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（2）pH值。以SPI溶液為底物，分別調(diào)節(jié)pH值至 5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在 TGase酶量 40 U/g，溫度55℃，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（3）交聯(lián)溫度。以SPI溶液為底物，交聯(lián)溫度分別為25，35，45，55，65℃，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（4）交聯(lián)時間。以SPI溶液為底物，交聯(lián)時間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，溫度45℃的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.2.2 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定

用去離子水配制1%的蛋白溶液，振蕩30 min充分溶解后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，再取30 mL上清液于高速分散器中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min均質(zhì) 1 min，記錄泡沫體積（V0，mL），靜置30 min后，再次記錄泡沫體積（V30，mL）[8]。按以下公式分別計算樣品的起泡性（Foaming Capacity，F(xiàn)C） 和泡沫穩(wěn)定性（Foaming Stability，F(xiàn)S）：

1.2.3 粒徑與Zeta電位的測定

分別取0.1 g SPI原料與不同交聯(lián)時間下的樣品溶解于10 mL去離子水中，使用高速分散器以轉(zhuǎn)速5 000 r/min均質(zhì)2 min完全混合，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后取上清液，用0.45 μm膜過濾后，測定粒徑及Zeta電位[9]。

1.2.4 游離巰基含量的測定

采用Ellman法[10]測定游離巰基（SH） 含量，取15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly-8 M Urea溶液中振蕩，加入100 μL Ellman試劑，于25℃下保溫30 min，再以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長412 nm處測定吸光度，以試劑空白校零，同時測定樣品空白。按以下公式計算游離巰基含量：

式中：A412——除去樣品空白和試劑空白后的吸光度；

D——稀釋倍數(shù)；

C——樣品中蛋白質(zhì)含量，g/L；

13 600——Ellman試劑摩爾吸光系數(shù)，M-1cm-1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007軟件繪圖，SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，每組試驗均重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準偏差表示，采用t檢驗，當p＜0.05時，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGase改善SPI起泡性、泡沫穩(wěn)定性研究

2.1.1 SPI原料的起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定結(jié)果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，通過公式（1）及（2）計算得到SPI原料的起泡性為35.90%，泡沫穩(wěn)定性為75.79%。

2.1.2 TGase交聯(lián)SPI對其起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

不同因素對TGase交聯(lián)SPI起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響見圖1。

圖1 不同因素對TGase交聯(lián)SPI起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖1（a）可知，隨著TGase酶的加入，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性也隨之增強，當酶用量為40 U/g時均達到最大，分別為42.07%和76.14%，之后呈現(xiàn)下降趨勢?？赡苁怯捎诿赣昧康脑黾邮沟妹概c蛋白的接觸概率增大，蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，膜上吸附的改性蛋白分子增加，膜的彈性及致密性提高，氣體不易向外擴散[11]，因此利于起泡，同時泡沫存在的時間也會延長。但TGase酶的過度加入則會破壞體系所需要的親水平衡，導致其起泡性和泡沫穩(wěn)定性降低，所以確定最優(yōu)酶用量為40 U/g。

由圖1（b）可知，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均先升高后降低，當pH值為6.0時達到最大，分別為45.95%和79.63%。由此可分析出，pH值對TGase交聯(lián)SPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有影響。大豆蛋白質(zhì)在pH值4.5左右時達到等電點，此時溶解度最低，易于形成沉淀，而起泡性和泡沫穩(wěn)定性均與溶解度有關(guān)[12]，所以在等電點附近，其起泡性和泡沫穩(wěn)定性較低，在遠離等電點后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。可溶性蛋白參與泡沫的形成，在等電點處可溶性蛋白濃度很低，形成的泡沫量很少。當pH值為6.0時，不溶性蛋白吸附在界面上，蛋白膜的黏著力增加，此時的體系有利于泡沫的形成[13]。隨著pH值的升高，溶液環(huán)境堿性增強，酶的活性隨之降低，使穩(wěn)定環(huán)境受到破壞，導致其起泡性和泡沫穩(wěn)定性減弱[14]，因此確定最佳pH值為6.0。

由圖1（c） 可知，起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增大，當溫度為45℃時達到峰值，分別為49.55%和81.91%，而后二者均下降。之所以出現(xiàn)此趨勢可能是因為TGase酶有自身的最適溫度，過低或過高都不利于TGase酶對SPI的交聯(lián)，而一定程度的交聯(lián)使蛋白分子疏水基團暴露，增加其吸附至界面的能力[15]。在最適溫度時，酶交聯(lián)反應速率最大，使蛋白分子得以最大程度的交聯(lián)。當高于最適溫度時，反應速率減小，同時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會遭到不同程度破壞，使蛋白質(zhì)與水的相互作用被削弱[16]，導致起泡性和泡沫穩(wěn)定性降低。另外，觀測到在45℃時產(chǎn)生的泡沫黏度比在其他溫度條件下產(chǎn)生的略大，說明此溫度下的泡沫穩(wěn)定性最好。綜上確定交聯(lián)反應的最適溫度為45℃。

由圖1（d）可知，隨著交聯(lián)時間的延長，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均隨之增強，交聯(lián)時間2 h時達到最大值，分別為52.65%和86.52%，而后略有下降。原因可能是在反應初期，隨著時間的延長，蛋白分子中-NH2、-COOH之間形成的氫鍵增加，致使蛋白膜之間的機械強度提高[17]，從而起泡性提高。當反應時間過長時，氣液兩相間薄膜強度降 低[18]，故泡沫穩(wěn)定性下降，起泡性也隨之下降。綜上確定交聯(lián)反應的最適時間為2 h。

2.2 起泡性、泡沫穩(wěn)定性與理化性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系

2.2.1 粒徑與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

粒徑與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見圖2。

圖2 粒徑與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性

SPI經(jīng)TGase酶的交聯(lián)作用使其粒徑增大，通過SPSS軟件中相關(guān)性分析得出，粒徑大小與起泡性（R=0.752）和泡沫穩(wěn)定性（R=0.623）之間均存在顯著正相關(guān)性（p＜0.01），由圖2（a）與（b）可知，這與楊峰等人[19]得出的結(jié)論一致。

2.2.2 Zeta電位與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

電位與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見圖3。

圖3 電位與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性

由圖3（a）可知，可以看出隨著Zeta電位絕對值的增加，其起泡性會出現(xiàn)明顯的上升趨勢。通過相關(guān)性分析得出，Zeta電位絕對值的大小與起泡性之間呈顯著正相關(guān)（R=0.672，p＜0.01）。但Zeta電位絕對值的大小與泡沫穩(wěn)定性之間并不存在相關(guān)性（R=0.399，p＞0.05）。

2.2.3 游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見圖4。

圖4 游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性

SPI經(jīng)TGase酶的交聯(lián)后，產(chǎn)物的游離巰基含量會發(fā)生變化。游離巰基含量的多少對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響很大，巰基是形成二硫鍵的原體，巰基和二硫鍵在蛋白分子結(jié)構(gòu)中起到重要的作用[20]。經(jīng)酶法改性后的蛋白多肽鏈構(gòu)象的改變反映在巰基及二硫鍵含量的變化上，故探討其對交聯(lián)產(chǎn)物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。

圖4（a）為游離巰基含量與起泡性之間的關(guān)系。由SPSS軟件中相關(guān)性分析得出，游離巰基含量與起泡性之間呈顯著負相關(guān)（R=-0.601，p＜0.01）。游離巰基含量少，起泡性反而大。游離巰基含量的變化引起其起泡性的顯著變化，說明游離巰基的含量可以影響其起泡性能，同時也驗證了交聯(lián)作用的發(fā)生。通過分析圖4（b）中游離巰基的含量與泡沫穩(wěn)定性相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，泡沫穩(wěn)定性與游離巰基含量之間的相關(guān)性稍差，游離巰基含量的變化并未導致其泡沫穩(wěn)定性顯著的升高或降低。由相關(guān)性分析可得出，游離巰基含量與泡沫穩(wěn)定性之間僅存在微弱的負相關(guān)性 （R=-0.475，p＜0.05）。

3 結(jié)論

以大豆分離蛋白為試驗原料，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在不同條件下交聯(lián)，探討酶用量、pH值、交聯(lián)溫度和交聯(lián)時間4個因素對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改善大豆分離蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，確定酶用量 40 U/g，pH值6.0，交聯(lián)溫度45℃，交聯(lián)時間2 h為改善起泡性和泡沫穩(wěn)定性的最優(yōu)條件，此時起泡性為52.65%，較SPI原料提高46.66%；泡沫穩(wěn)定性為86.52%，較SPI原料提高14.16%。

通過分析粒徑、Zeta電位、游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的關(guān)系，得到以下結(jié)論：粒徑大小與起泡性和泡沫穩(wěn)定性之間均存在顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.752和0.623（p＜0.01）。Zeta電位絕對值的大小與起泡性之間呈顯著正相關(guān)（R=0.672，p＜0.01），但與泡沫穩(wěn)定性之間并不存在相關(guān)性（R=0.399，p＞0.05）。游離巰基含量與起泡性之間呈顯著負相關(guān)（R=-0.601，p＜0.01），與泡沫穩(wěn)定性之間呈負相關(guān) （R=-0.475，p＜0.05）。